水中大肠菌群快速检测方法－酶底物法与多管发酵法的比较 《卫生研究》2006第3期 孙宗科 丁培 薛金荣 陈西平1 吴榕2 张雅婕3 张淑红4 遇晓杰5 中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所，北京 100021
摘要： 目的 比较酶底物法与多管发酵法用于水中大肠菌群的检测。 方法 应用加标试验和实际水样检测的方式，比较酶底物法与多管发酵法用于水中大肠菌群检测结果的一致性，以及假阳性率。 结果 酶底物法与多管发酵法用于水中大肠菌群检测结果具有一致性，假阳性率无统计学意义的差别。 结论 酶底物法可以用作评价水质微生物污染的标准方法。 关键词：大肠菌群 酶底物法 多管发酵法 快速检测
Comparison between rapid detection method of enzyme substrate technique and multiple-tube fermentation technique in water coliform bacteria detection
Sun Zongke, Wu Rong, Chen Xiping, et al. Institute for Environment Hygiene and Health Related Product Safety, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100021, China
Abstract：In order to compare between rapid detection method of enzyme substrate technique and multiple-tube fermentation technique in water coliform bacteria detection, inoculated and real water samples are included in this experiment. Results demonstrate that enzyme substrate technique shows equivalence with multiple-tube fermentation technique. It is suggested that enzyme substrate technique can be used as a standard method for water microbiological safety evaluation.
Key words：coliform bacteria, enzyme substrate technique, multiple-tube fermentation technique, rapid detection
目前我国对生活饮用水、水源水、地表水等进行卫生学评价，检测的指标为大肠菌群（coliform bacteria）和粪大肠菌群(faecal coliforms)，以这两种指标作为粪便污染的指示菌。采用的标准检测方法为膜过滤法（MF）和多管发酵法（MTF）。但这两种方法检测时间相对较长，需2～5天，需验证试验，试验步骤较为繁琐，不能对水的卫生学状况做出快速评价。因此，采用快速简便的检测方法十分必要。酶底物法可以较好的弥补传统方法的不足。 酶底物法（enzyme substrate technique）采用大肠菌群细菌能产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）使培养液呈黄色，以及大肠埃希氏菌产生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解MUG（4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide）使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的原理，来判断水样中是否含有大肠菌群及大肠埃希氏菌。酶底物法可以采用成品的培养基及试剂，
基金项目：GB/T 5750《生活饮用水标准检验方法》修订工作项目。 作者简介：孙宗科，男，实习研究员 责任作者：陈西平，男，研究员 1中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所，2 农业部食品质量监督检验测试中心（上海），3 北京市疾病预防控制中心，4 河北省疾病预防控制中心，5 黑龙江省疾病预防控制中心 操作方便；无需确认试验；酶底物法检测时间较短，18h-24h即可同时判断水样中大肠菌群和大肠埃希氏菌的MPN值。 由于酶底物法用于水样定量检测时采用最可能数（MPN，most probable number）的技术和方法，所以，本项试验中比较酶底物法与多管发酵法用于水样的检测。
材料与方法 材料与试剂。本试验中酶底物法采用指定受检物检验技术（DST，defined substrate technology），其MMO-MUG培养基、试验材料和仪器由爱德士公司提供，试验菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心和中国医学微生物菌种保藏管理中心，细菌鉴定用API 20E由生物梅里埃公司提供。其它所用培养基与试剂按《生活饮用水卫生规范》2001准备和配置。 试验方法。酶底物法采用51孔定量盘法，此方法是一种基于MPN的方法。检测所需水样为100mL。用100 ml的无菌稀释瓶量取100 ml水样，加入2.7±0.5 g MMO-MUG培养基粉末，混摇均匀使之完全溶解，将水样全部倒入51孔无菌定量盘内，以手抚平定量盘背面以赶除孔穴内气泡，然后用封口机封口。放入37℃培养箱中培养24小时后进行结果判读，如果结果为可疑阳性，可延长培养时间到28小时，超过28h之后出现的颜色反应不作为阳性结果。将培养24小时之后的定量盘取出观察，如果孔穴内的水样变成黄色则表示该孔穴中含有大肠菌群。将定量盘在暗处用波长为366 nm的紫外光灯照射，有黄色反应的孔穴如果有蓝色的荧光产生则表示该定量盘孔穴中含有大肠埃希氏菌。计算有黄色反应及有荧光的孔穴数，对照MPN表查出其代表的大肠菌群及大肠埃希氏菌最可能数。 多管发酵法检测大肠菌群和粪大肠菌群方法参见《生活饮用水卫生规范》2001。 数据统计。数据整理统计方法使用 excel和SPSS10.0软件。
试验结果 加标试验。对大肠埃希氏菌32件加标水样进行大肠菌群酶底物法与多管发酵法比对实验，试验结果如图1。
大肠埃希氏菌加标水样检出结果
0102030405060161116212631样品编号MPN值多管发酵法MPN/100ml酶底物法MPN/100ml 图1 加标水样酶底物法与多管发酵法检出结果 对检出的结果进行配对t检验，检验结果表明多管发酵法与酶底物法检测结果没有统计学意义上的差别（P＝0.384）。 水样检测。采取地表水水样进行检测，为保证试验结果的精确和方便统计，要求水样有一定的阳性检出率，同时水样的MPN值应尽量控制在100MPN/100ml以下，以10~30MPN/100ml为宜[1]。在本项试验中采用100件地表水水样同时进行大肠菌群和大肠埃希氏菌（或粪大肠菌群）的检测。检测结果如图2及图3。
水样酶底物法与多管发酵法大肠菌群检测结果
020406080100120140
序号102030405060708090样品编号
MPN值
多管发酵法MPN/100ml酶底物法MPN/100ml 图2 水样酶底物法与多管发酵法大肠菌群检出结果 对两种方法检测的大肠菌群结果进行配对t检验，检验结果表明多管发酵法与酶底物法检测结果没有统计学意义上的差别（P＝0.059）。
水样酶底物法与多管发酵法大肠埃希氏菌（或粪大肠菌群）检测结果
05101520
序号102030405060708090样品编号
MPN值
多管发酵法MPN/100ml酶底物法MPN/100ml 图3 水样酶底物法与多管发酵法大肠埃希氏菌（或粪大肠菌群）检出结果 对两种方法检测的大肠埃希氏菌与粪大肠菌群结果进行配对t检验，检验结果表明多管发酵法与酶底物法检测结果有统计学意义上的差别（P＝0.000），多管发酵法检出的粪大肠菌群要多于酶底物法检出的大肠埃希氏菌。对两种方法检测结果进行线性回归分析，结果如表1。
表1 酶底物法与多管发酵法检测结果的线性回归分析 Coefficientsa
-.025.170-.150.881.544.034.85116.049.000(Constant)多管发酵法粪大肠菌群Model1
BStd. ErrorUnstandardizedCoefficientsBetaStandardizedCoefficientstSig.
Dependent Variable: colilert大肠杆菌a. 回归分析结果表明：回归系数（B）为0.544，标准化回归系数（Beta）为0.851，回归系数t检验t＝16.049，P=0.000<0.05，可认为酶底物法检测结果与多管发酵法结果之间有相关关系。 确认试验。为比较两种方法的假阳性率，对试验结果进行确认试验。取水样进行预试验后，使水样MPN值控制在5~30MPN／100ml之间。取6个水样进行验证试验。这6个水样多管发酵法和酶底物法结果如表2。 表2 验证试验所需水样多管发酵法和酶底物法检测结果
序号 多管发酵法 酶底物法 大肠菌群阳性管数 MPN 粪大肠菌群阳性管数 MPN 大肠菌群阳性孔数 MPN 大肠埃希氏菌阳性孔数 MPN
1 3-2-0 14 2-0-0 5 8 8.7 4 4.2 2 4-1-0 17 3-0-0 8 10 11.1 2 2.0 3 2-0-0 5 1-0-0 2 2 2.0 1 1.0 4 4-2-0 22 3-1-0 11 11 12.4 2 2.0 5 4-3-0 27 4-1-0 17 16 19.2 7 7.5 6 3-2-0 14 3-1-0 11 6 6.4 3 3.1 合计 30 / 19 / 53 / 19 /
确认试验步骤为如图4。