１０７６第２０卷第１０期医学研究生学报Ｖ０１．２０Ｎ。．１０２００７年１０月ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃａｌＰｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅｓ
Ｏｃｔ·２００７
·综述·质谱技术在蛋白质组学中的应用发展吴晓歌综述，鲁新宇审校（南京工业大学应用化学系，江苏南京２１０００９）
摘要：蛋白质组学能阐明基因组所表达的执行生命活动的蛋白生物学功能。其研究成果为药物和临床医学提供了新的发展方向。作者就近年来国际上重点研究的几类质谱技术在蛋白质组定性、定量研究中的最新进展以及它们在蛋白质组研究中的优点和发展前景作一综述。关键词：蛋白质组学；质谱中图分类号：Ｑ５１文献标识码：Ａ文章编号：１００８－８１９９（２００７）１０·１０７６４）３
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ－ｂａｓｅｄｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓＷＵＸｉａｏ—ｇｅｒｅｖｉｅｗｉｎｇ，ＬＵＸｉｎ－ｙｕｃｈｅｃｋｉｎｇ
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Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＳｔｕｄｙｏｎｐｍｔｅｏｍｉｃｓｃａｌｌｅｘｐｌａｉｎｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｅｘｅｃｕｔｉｎｇｌｉｆｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｐｒｅｓｓｅｄｂｙｇｅｎｏｍｅＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｐｏｉｎｔｔｏａｆｌｅｗｄｉｒｅｃｔｉｏｎｆｏｒｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
ａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌ
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Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ；Ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ
０引言关研究进展作一综述。生命科学的研究已进入了功能基因组时代，蛋白质组学作为功能基因组学的重要支柱，在２０世纪９０年代中期产生。蛋白质组学研究要求准确、快速、大规模地鉴定蛋白质。在等离子体解吸质谱和快原子轰击电离质谱软电离技术出现后，质谱可测的相对分子质量已达数千。质谱技术从此成为蛋白质组学研究的核心技术。随着质谱技术的不断进步．高效、高灵敏度、高通量的运用于蛋白质组学研究的质谱仪器不断涌现，人们在医药和生化领域都受益颇多。本文作者就最近的相
收稿日期基金项目作者简介通讯作者１蛋白质组与质谱蛋白质组（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ）的概念在２０世纪９０年代提出，其内容主要包括对蛋白质组的定性、定量和从功能角度分析大量蛋白质…。作为后基因组时代的一个新领域，蛋白质组学通过在蛋白质水平上对整体基因表达的同步分析研究生物系统，揭示各种表达基因和基因产品之间的关系；但研究方法仍然存在着一些问题，包括如何不失真的样品分离，如何提高对复杂生物基质分析的选择性和准确性，如何实现大规模、高通量和自动化筛选蛋白质等。蛋白质２００７－０３－２１；修订日期：２００７４】６－２２国家“十五”科技攻关计划基金资助项目（批准号：２００４ＢＡＴ０６８／Ｊ３４Ｍ）吴晓歌（１９８５一），女，江苏南京＾，理学硕士研究生，从事应用化学专业。鲁新宇（１９５３．）．盘，扛苏无锡人，副教授，理学学士．从事应用化学专业。
万方数据第１０期吴晓歌，等质谱技术在蛋白质组学中的应用发展１０７７
组学的诞生与仪器和分析技术的发展密不可分．作为近年来蛋白质组核心研究技术——质谱法的发展更是推动蛋白质组研究的中坚力量。近１０年间，质谱仪器和质谱技术的革新，推动了蛋白质化学的研究。电喷雾电离和基质辅助激光解吸电离两项“软电离”技术的出现．使得对蛋白质组快速、准确、灵敏和高通量的检测成为可能”’］。这些电离方式对样品的破坏性小，质量测定范围大，相对分子质量测定准确，样品纯度要求不高，十分适合分析成分复杂的微生物样品。
１．１电喷雾电离技术电喷雾电离技术的原理是：将和样品溶液在电场的作用下形成高表面电荷密度的雾滴。带电荷的样品离子被静电力喷人气相而进入质量分析器”Ｊ。样品中含有缓冲液、盐和去垢剂，可能与待测物形成混合物．导致产生难以指认的分子量或抑制待测物离子的形成”】。电喷雾电离源与分离技术的联用，如离子化前使用高教液相色谱或电泳分离杂质可解决这一问题。另外，纳米电喷雾电离技术的引用，虽可减低溶剂流速，以提高灵敏度，但是这要求样品容量＜１ｍ”Ｊ。
１．２基质辅助激光解吸附质谱技术这一技术是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，通过激光照射晶体导致基质晶体升华，致使干燥的基质和分析物膨胀，并进入气相。理想的基质应该具有较好的水溶性、较小的挥发性和一定的化学惰性…。基质辅助激光解吸附质谱技术的开发，大致有两个方向：一是通过附加测序能力，具体化基质辅助激光解吸附质谱对蛋白质鉴定；二是通过耦舍二维凝胶电泳，延展基质辅助激光解吸附质谱分析复杂的多肽混合物的能力。２质谱法对蛋白质组学的定性研究２１肤质量指纹法基质辅助激光解吸电离一飞行时间质谱测量法，以多肽质量／电荷比为依据同数据库资料进行比较，进而对蛋白质进行鉴定。此法通常被称为肽质量指纹法。肽质量指纹法是在测定前进行透析，有效去除了盐分，可得到满意的样品峰。依靠可靠的数据库检索，仅用少量的肽片段即可鉴定蛋白质。基质辅助激光解吸电离能够耐受少量杂质的存在，对于纯度不是很高的样品也能得到理想的结果。因此，肽质量指纹法被认为是鉴定蛋白质最常用、最快速、最有效的方法”Ｊ。肽质量指纹法的关键是相对分子质量的精确度，但蛋白质翻译的多种可能性易导致错误鉴定．所以该法通常只能适用于已完成测序、数据库注释详尽的小基因组的生物。但随着搜索数据库算法的增强，肽质量指纹法得到进一步的发展。此外，近５年来，以信息为基础的评分功能（ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ－ｂａｓｅｄｓｃｏｒｉｎｇｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）可以快速选择候选评分复杂蛋白质，使鉴定精度大为提高”。…。２２色谱与质谱连用将色谱技术与新型质谱技术相结合，可有效地克服双向凝胶电５２，／质谱的不足，确保了分析的准确性。色谱和质谱连用鉴定蛋白质组技术是由Ｙａｔｅｓ的实验室首先介绍的，先对蛋白质混合物进行酶切得到混合肽段，然后通过强离子交换反相色谱柱进行多次分离，并连用液相色谱一串联质谱分析肽段，而且通过核素标记肽段的技术实现蛋白定量分析”１‘“１。分离后的产品离子得到完好地扫描，连用分析肽段，可以区分待测蛋白质和其他类似物。色谱、质谱连用技术发展迅速，但是由于蛋白质不易完全分离。导致质谱峰重叠，降低了鉴定的准确性。另外，由于蛋白质翻译后修饰．源于相同基因的蛋白质可能迁移至不同位置，也会对鉴定造成困难。一些新的联用方式．如反相色谱与二维凝胶电泳与质谱的联用。强阳离子交换色谱与质谱的联用，以及高效液相色谱与傅立叶变换质量分析器的联用，使情况大为改观。２．３串联质谱技术蛋白质串联质谱鉴定是利用了肽段氨基酸序列的特异性，其鉴定蛋白质的特异性更高，仅一条肽段就可鉴定蛋白质，可用于蛋白质混和物的鉴定。适当调整后，可鉴定蛋白质翻译后修饰，它是目前鉴定蛋白质常用的方法”“。大致分为空间串联质谱和时间串联质谱。离子阱质量分析器耦合时间串联质谱，可在同一个质量分析器上完成母离子选择、存储、分裂和检测工作。单一运用空间串联质谱完成同类工作需要几个分析器。相对地，离子阱质量分析器耦合时间串联质谱，可有效地去除其他碎片离子的干扰，适应在复杂背景下分析，具有高离子通量和高效的优点。串联质谱技术要求样品纯化，难于自动化，费时，仪器昂贵，难以操作和维护，所以未能普及至常规实验室。将色谱与串联质谱连用是近年来研究蛋白质组的新方法。反相液相层析质谱配置了涡轮离子喷雾离子源，监测备选离子
的三重四极质量分析器，通过多反应监控获取离子方式（正离子），敏感、高效地测定了沙海葵毒素”“。
３质谱法对蛋白质组学的定量研究３．１内源标定与液相色谱一串联质谱技术结合内源标定技术分为稳定核素标记法和核素编码亲和标签法。稳定核索标记法与液相色谱一串联质谱连用量化准确性较高，回收率高，检测线低。选用特别标记的肽为内标，克服分离后的错误信息。一般用化学方法、酶切法或代谢法引入肽或蛋白质。在分析前，标记含有氨基酸的特定功能体。减少样品复杂性。如需要进一步降低复杂样品，可在质谱分析
万方数据１０７８医学研究生学报２００７年１０月第２０卷前用多维解离¨７川。稳定核素标记法也可在细胞培养过程中进行。从培养的细胞库中提取其中蛋白质，分离后对凝胶上蛋白斑点酶切，利Ｊ【｛；｛每个多肽一对核素离子的强度测定相对丰度。核素编码亲和标签方法以特定半胱氯酸为基础，在蛋白质组中的蛋白质样品上标记核素生物亲和力标签。标记的蛋白质经酶切产生肽。这种方法通过富集半胱氨酸，降低了肽混合物的复杂性。但在分离过程中，大量不舍有半胱氨酸的肽也会被分离，导致串联质谱图谱中未知蛋白质核质比等定性、定量凼素改变。因此，核素编码亲和标签法仅能准确定量测量已知蛋白质，对未知物的定量是不准确的”…。在线高效液相分离色谱．飞行时间质量分析器质普法在保持原有技术优点的同时，通过过滤从亲和力色谱分离的肽，提高了含半胱氨酸的纯度。而连用四机杆飞行时间质量分析器，以精确度较高的比例表达收集到的分离碎片。此技术已被运用至区分癌细胞和人类正常前列腺细胞。但离线分析会导致样品流失，降低通量。３．２定量半耽氨酸浓缩技术（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｃｙｓｔｅｉｎｙｌ－ｐｅｐｔｌｄｅｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＱＣＥＴ）是一种新的定量技术，利用高通量定量蛋白质组稳定核素标记技术结合高分辨率的液相色谱一质谱，具有更高的效率和较大动态范周。其主要步骤顺序：①从两个细胞中准备蛋白质样品，分别在胰酶消化的相同条件下．肽的每个样品通过固定一胰蛋白酶催化氧气交换，由分别”０或”Ｏ标记。②有特定标记的两个肽样品，有选择性地结合半胱氨酸。通过精细的洗涤，半胱氯酸从树脂中释放。③富集的胱氨酸用标签方法分析鉴定，并量化。这种方法涉及核素标记肽、高效浓缩含半胱氢酸肽、蛋白质大规模鉴定和准确定量以及使用时间标签。这项技术的优点包括以下几个方面：①用简单、高效的方法富集胱肽；②高通量蛋白质组分析法适应广泛；③提高工作效率，更好地标记定量测量。这项技术提高了系统的功能分析和检测临床生物的潜力…。４结语不同离子源和质量分析器的联用，可提高质谱法的灵敏度和质量检测线性范围；不同分离技术和质谱法的连删能够更有效地分离蛋白质，提取肽，从而提高准确性。质谱技术发展空间广阔，难度和投入较小，近年来发展迅速。同时，质谱法和平行的生物、化学研究方法的结合。也使得对蛋白质的结构、功能、蛋白质在蛋白质组中的定位等的认识更加深人。人类基因组的研究以及对生命本质的认识将达到新的高度。参考文献［１］Ｄｌ蚰ｅｃＭ鹊ｓｓｐｅｅｔｍｍｅｔ，７：ｇａｉｎｉｎｇｍａ∞ａｐｐｅａｌｉｎｐ耐…８［』］ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ，２００５，２（６）：ｄ，６５－４７１【２］Ｔａ…ｎｋＮ【，Ｐｏｔ【ｅｒⅣＴ，Ａｌｌｍ口ＳＬ，ｄａｔＧｅｎｄｅｒｉｄｅｎｔｉｆｉｅａ－ｌｉｏｎｈａｔｆｉ＊一ＡｓｓｍｔｅｄＬ曲ｅｒｄｅ∞ｒｍｌ衄／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ…ｐ∞ｔｍｍ“ｗ［Ｊ］ＡｎａｌＣｈｅｍ，１９９９，７ｌ（１０）：３９７４－３９７６［３】ＳｅｈｏｍｎｌｍｒｇＭ，Ｄｍ】＊“Ｋ．Ｈｉｌｌｅｎ．ｋ“ｐＰｋｄｅｑｔ，ｔｌｔ，ｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｍａ∞ｓｐｅｃｔｗｍｅｔｒｙｏｆｐｅｐｔｉｄｅａ卸ｄｐｍｔ￡ＩｌｌＢｗｉｔｈｐａｒｔｉｃｌｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｍａｌｆｉｘ船［Ｊ］ＡｎａｌＣｈｅｍ，１９９９，７１（１）：２２１－２２９【４】钱小红，盛龙生生物质谱技术与方法［Ｍ】北京：科学出版杜．２００３：１７１－１７２【５】ＪｕｄｉｔｈＨＰｒｏｄｕｃｔｍｖｉｅｗ：Ｐｒｏｔ∞ｍｉｃｓｓｙｓｔｅｍ…口［Ｊ］Ａｎａｌｃｈ㈨，２００１，７３（Ｊ３）：３７９Ａ－３８３Ａ．【６】Ｊ０ｅⅥＲ．ｕｎＬ．Ｊ∞Ｍ，ｄ０２Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｉｎｍ∞８ｓｐｅｅｔ—ｔｒｙ—ｂａｓｅｄｐｍｌ帅ｍｌｅｓ［Ｊ１Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００４，４（１２）：３６８７－３７０３【７］蒋娟娟基质辅助激光解吸离子化中的基质和摹质添加刺【Ｊ］药物进展，２００４．２８（８）：３４９－３５０【ｇ］Ｋ㈨∽Ｅ．ＷｅｍｅｈｕｈＨ，ＪｕｎｇｂｌｕｔＰＲｎｅＤｏｍｉⅢｃｅｏｆＡ口ｎｉｎｅⅧｏｎｔａｌｎｉｎｇｐｅｐｔｉｄｃｓｉｎＭＡＩ—ＤＩ－Ｄｅｒｉｖｅｄｈ３，ｐｔｉｃｍ啪Ｆｉｎｇ忏ｐｒｉｎｔ“ｐｔｏｔｅｉｎｉ［Ｊ］ＡｎａｌＣｈｅｍ，１９９９，７１（１９）：４１００，，４１６５［９］Ｍｐ肿ｈ曲肛ＣＰ．ＣｈｅｎＢ，ＭｅｌａｙＩ．ｄａｌＫｎｏｗｉｅｄｇｅ、ｂａｓｅｄｉｎ—ｋｒ卵ｔ，ｏｎｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓｃｏｆｉａｇ：ａｓｉｍｐｌｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒ珊ｍｏｖｌＩｌｇｔｈｅｅＨｈＩｍｎ唧ｏｆｆａｓｔ∞ｏｒｉｎｇｆｎｎｅｔｉｏ曲［Ｊ］ｃｈ锄ｌｉｆｔＭｏｄｅｌ，