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细胞因子
病毒、细菌 寄生虫、过敏源
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细胞因子相关的主要研究领域
• 肿瘤 • 肾炎 • 感 染 （ SARS/ 禽 流 • 基于细胞水平的研究 感） • 胞内因子 • 胞外因子 • 自身免疫病 • 超敏反应 • 移植排斥反应 • 免疫缺陷病 • 血液疾病
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胞内因子测定
原理：
• 未活化的细胞所分泌的细胞因子很少，很难在流式细胞
• 在细胞因子（如GM-CSF，IL-4和TNF-α）的作用 荧 光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分 析和分选基础上发展起来的对细胞的物 理或化学性质（如大小、内部结构、 DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速 测量并可分类收集。
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流式细胞术概述
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流式细胞术概述
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流式细胞术概述
流式细胞仪检测细胞特性
细胞组成
大小
细胞功能
细胞表面/胞浆/核--特异性抗原
CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例
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六、自身免疫病相关HLA抗原分析
HLA-B27可出现在58%～97%的强直 性脊椎炎(As) 患者
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流式细胞仪的科研应用
免疫功能研究（淋巴细胞亚群分析、细胞活化、 细胞因子）
磷酸化蛋白的检测
干细胞研究/树突细胞研究 细胞功能研究（细胞内PH值、细胞内钙离子流、 细胞膜电位、线粒体膜电位） 血小板分析（心脑血管疾病）
• •
•
仪上检测。 需用刺激剂PMA+Ionomycin等激活细胞分泌细胞因子， 为了阻止产生的细胞因子分泌到细胞外，需要同时加入 BrefedlinA或Monensin等共孵育细胞，使胞内细胞因子 蓄积。 胞内染色前需用多聚甲醛固定，保留细胞形态完整性和 胞内物质抗原性，随后用皂角苷（破膜剂）增加细胞膜 通透性，使细胞因子特异性抗体渗入到胞内，达到流式 细胞仪检测目的。
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侧向散射光（side scatter, SSC）：激光束照射细胞时，
光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
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测得的FSC与 SSC信号通过计算机 处理，可得到FS-SS 图，由此可仅用散 射光信号对未染色 的活细胞进行分析 或分选。 此为血细胞分 类的基本原理，但 不能分析表面分子。
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流式细胞仪的临床应用
HIV免疫分型，CD4绝对计数 淋巴细胞亚群分析 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的免疫状态监测 干细胞计数 阵发性血红蛋白尿 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病
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一、淋巴细胞及其亚群的分析
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DC的表面标志
• 人DC的主要特征性表面标志为CD1a和CD83， CD83还是DC充分成熟的标志。 • 成熟DC高表达CD80（B7-1），CD86，CD40和 CD54等共刺激分子，而未成熟DC不表达或低表 达这些分子
• 未成熟DC具有强大的内吞作用，并高表达大多
数趋化因子受体
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DC的分化
学、临床医学、药物学、材料学等众多研究领域中的 应用有更加突飞猛进的发展。
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流式细胞术概述 流式细胞术最大的特点是能在保持细
胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏
的状态下，通过荧光探针的协助，从分子
水平上获取多种信号对细胞进行定量分析
或纯化分选。
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
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流式细胞术概述
粒度
DNA, RNA含量
细胞活性
胞内细胞因子
蛋白质含量
钙离子,PH值,膜电位
激素结合位点
酶活性
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工作原理
采用激光作为激发光源，保证其具有更好
的单色性与激发效率；
利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标
记技术，保证检测的灵敏度和特异性；
用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个
细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保
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二、淋巴细胞功能分析 • 细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细 胞比例) • 细胞内细胞因子测定
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三、淋巴造血系统及白血病免疫分型
对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型 用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留 病变
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四、肿瘤耐药基因分析
MDR(+)表示对化疗药物耐药
五、AIDS病检测中的应用
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DC的表面标志
• 所有DC共同的突出特点是能高水平表达MHC-II类分子
如HLA-DR。DC成熟过程突出的标志是MHC-II类分子
的重分布，从主要在细胞浆内转变为主要在细胞膜表面.
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体外人DC制备
• 前体DC来源
外周血单个核细胞/单核细胞 • 密度梯度离心 • BD™ IMag Cell Separation System 骨髓、新生儿脐带血的CD34+细胞
粒被染上荧光部分数量的多少，根据其标记的抗原分子不
同，即反映了不同抗原分子的表达情况。 同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照，可使荧光标记 单抗的信号保持其特异性。
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概述 流式细胞仪的基本应用 流式细胞术在临床与科研的应用 近期流式细胞术应用研究进展
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流式细胞仪的基本应用 • Cell surface markers
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流式细胞仪的科研应用
肿瘤相关基因表达的研究 抗肿瘤药物作用机制以及多药耐药性的研究
细胞周期和倍体分析
细胞凋亡及凋亡相关蛋白
转染&基因沉默效率检测
细胞分选、分选后培养及相关生物学研究
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概述 流式细胞仪的基本应用 流式细胞术在临床与科研的应用 近期流式细胞术应用研究进展
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
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荧光测量
• 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激 发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 • 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过 波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧 光信号区分开，送入不同的光电倍增管。 • 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。 • 线性放大器和对数放大器
细胞悬液形成液流柱
压电晶体 产生机械振动
流动室振动 液流断裂成液滴
空白液滴
含细胞的液滴 充电 偏转落入收集器
不充电 弃去
流式细胞术发展趋势
①流式细胞仪从单纯大型仪器发展为适应各种实际 应用的便携式、台式、分辨率、高质量分选的研 究型流式细胞仪; ②对流式细胞术检测荧光参数,从采用荧光单色、 双色分析发展为多色分析,目前最多可同时检测 15 种荧光信号; ③从检测参数的相对定量发展为绝对定量; ④从检测参数的手动人工分析发展为利用计算机软 件的自动分析; ⑤所采用的荧光试剂,从非配套试剂发展为配套的 试剂盒试剂
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如十字门分析时，起
就可以由四个区域构 成，即
G=D1+D2+D3+D4。
CD4 PE
D1 CD4+/CD3-
D2 CD4+/CD3+
D3 CD4- /CD3D4 CD4- /CD3+
CD3 FITC
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小 结
流式细胞术（FCM）是在保持细胞及细胞器或微粒的结
构及功能不被破坏的状态下，从分子水平上获取多种信号 实现对单个细胞进行定量分析或纯化分选。 FCM分析中前向散射光反映颗粒的大小；侧向散射光反 映颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度；荧光反映颗
• Intracellular cytokines • Sorting to isolate cell populations
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免疫细胞的检测
• 免疫细胞的计数 T细胞及其亚群 Th细胞亚群 B细胞 NK细胞
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胞内因子测定
• 原理：
未活化的细胞所分泌的细胞因子很少，很难在流式细胞
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DC的生物学功能
• 是一类抗原呈递细胞（APC），将抗原递呈给特殊 的初始T淋巴细胞，引发初次免疫反应，在诱导免 疫耐受和调控免疫活性方面扮演着重要角色，是 机体内惟一能激活初始T细胞的APC。 • 通过激活巨噬细胞，NK细胞和嗜酸性粒细胞引发 机体对入侵感染因素的反应，连接天然免疫系统 和适应性免疫系统 • 受细胞因子调控的同时, 本身也可产生多种细胞 因子, 如IFN-α, IL - 12, GM - CSF, IL - 1, IL - 6和TNF- α等
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胞内因子测定
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胞内因子测定
血清、血浆或培养液上清、眼泪、房水等各种液相中 可溶性细胞因子的浓度检测 • 免疫性疾病的检测与监控 • 传染性疾病
• 肿瘤临床研究
• 总体免疫功能分析 • 药效评价
• 细胞凋亡等信号传导研究，磷酸化蛋白定量分析等
• 免疫细胞功能性研究 • 疫苗研发
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分选基本原理
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胞内因子测定
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树突状细胞 （dendritic cell，DC）
DC的生物学特点
• DC因其具有膜样或树突样突起而得名
• DC包括郎罕氏细胞、间隙DC、滤泡DC（FDC）、并指 DC（IDC）等等。其在体内含量甚微，仅占外周血单 个核细胞（PBMC）的1％以下， 但分布非常广泛， 在血液、肝、脾、淋巴结及非免疫器官组织中都有 存在。
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荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
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参 数
FSC：反映颗粒的大小
SSC：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少
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流式细胞术
流式细胞术的基本原理
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免疫细胞的检测
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免疫细胞的检测