橙红色
• PE－CY5：
深红色
• PerCP：
深红色
• PE－CY7：
深红色
• 7AAD：
深红色
• PI(碘化丙啶）：
橙红色
– 488nm波长的氩离子激光激发
525nm 575nm 610nm 675nm 675nm 755nm 675nm 620nm
光路补偿
FITC/PE/ECD/PC5
三 FCM的数据分析
1 流式细胞术的临床应用
• 白血病免疫分型 • HLA-B27: 强直性脊柱炎 • 淋巴细胞亚群 • 造血干细胞计数：造血干细胞移植 • 网织红细胞 • PNH诊断（CD55、CD59） • 血小板活化试验
2 流式细胞术的科研应用
• 细胞大小 • 细胞的颗粒度 • 细胞表面分子：CD 系列 • 细胞浆内分子：胞内细胞因子 • 细胞核内分子：P53 • 细胞功能检测：细胞周期、凋亡
675BP FL4 (PC5)
Side Scatter Detector
645DL
600DL 550DL
488BK 488DL
High Sensitivity Quartz Flow Cell
Forward Scatter Detector
检测系统
电路 电压调节
• 光电倍增管 • 电压 volts • 增益 Gain • 信号放大方式
光路（光学系统） • 光源 • 滤片
电路（检测系统） • 光电倍增管PMT • 放大电路HV及GAIN 增益 • A/D转换
统计 （分析系统） • 计算机
液流系统
• 流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激 光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻 璃中央开一个孔径为430μm×180μm的长方形孔， 供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流 动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照 时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角 收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。
1. 单参数一维直方图
纵坐标表示细胞数，横坐标表示相对荧光 信号或散色光信号值，单位是道数。
2. 双参数二维点图
显示来自同一细胞的两个参数与细胞数量间的关系。 横、纵坐标分别表示两个参数的相对含量。通过分别 计算两坐标所表示参数的阳性率来得到实验结果。
3. 等高线图
4. 密度图
四 FCM的应用
C） Annexin V Assay
磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内 侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞 膜的表面，暴露在细胞外环境中 , Annexin-V是一种分子量为 35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异 性结合
•为脂溶性，主 动进入细胞
•UV激发
G2M G1 G0
s
0
Count
DNA Analysis
G0G1
s G2 M
200
400
2N
600
800
4N
1000
DNA Analysis
300
225
150
Counts
75
0
0
200
400
600
800
1000
2N
4N
PI Fluorescence
3） Apoptosis 检测
检测系统
• 电信号输入到放大器放大，放大器分两 类：线性放大和对数放大。
• 细胞DNA含量、RNA含量等的测量一般 选用线性放大测量。
• 在细胞膜表面抗原等的检测时，细胞膜 表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚 至几万倍，通常使用对数放大器。
常用荧光染料介绍
• FITC：
绿色
• PE：
橙黄色
• ECD：
光学系统
信号
• 散射光信号
FS 细胞大小 SS 细胞颗粒性
• 荧光信号
FL1 – FITC FL2 – PE FL3 – ECD FL4 – PC5
光学系统 流式细胞仪光路图
Air-cooled Argon Ion Laser Beam Shaping Lenses
620BP FL3 (ECD) 575BP FL2 (PE) 525BP FL1 (FITC)
流式细胞仪的特点
单个细胞或微粒分析 同时多参数分析 速度快：10000个细胞(微粒)/秒 统计学意义：提供细胞群体的均值和
分布情况 分选感兴趣的细胞或微粒
举例：细胞周期分布检测
二 构造及工作原理
流路 (液流系统） • 流动室 • 鞘液SHEATH • 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml
A） DNA片断化检测
细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA 在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300kbp长的DNA大片 段, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段
B） Caspase-3活性的检测
Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用， 其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多 途径中发挥功能。
1） 蛋白表达的检测
荧光信号的定量可以用 平均荧光强度（mean 值），荧光信号面积（Area，A）来表示。
2）DNA Analysis
常用的DNA 染料
PI Ethidium Bromide Acridine Orange
•不能主动进 入细胞，需 要固定打孔
•488nm激发
DAPI (UV excitable) Hoechst 33342 (viable, UV excitable)
液流系统
流动室
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
光学系统
激光光源：目前台式机FCM，大多采用 氩离子气体激光器。激光(laser)是—种 相干光源，它能提供单波长、高强度及 稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速 分析的理想光源。由于细胞快速流动， 每个细胞经过光照区的时间仅为1μs左右， 每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧 光信号强弱，与被照射的时间和激发光 的强度有关，因此细胞需要足够的光照 强度。
流式细胞术的原理与应用
一 简介 ห้องสมุดไป่ตู้ 构造及工作原理 三 FCM的数据分析 四 FCM的应用 五 实例
一 简介
流式细胞仪(Flow Cytometer):是集激光技 术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技 术、细胞荧光化学技术以及单克隆抗体技术为 一体的高科技细胞分析仪。
流式细胞术(Flow Cytometry，FCM):利用 流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞 或亚细胞结构进行多参数、快速的定量分析和 分选的技术。