多糖分离纯化的基本原则和方法多聚糖(polysaccharide), 简称多糖, 常由一百个以上甚至几千个单糖基经过糖苷键连接而成的, 其性质已大不同于单糖, 如甜味和强的还原性已经消失, 广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中, 是构成生命的四大基本物质之一, 与生命功能的维持密切相关。

近年来, 大量研究表明多糖除了有增强免疫功能、抗肿瘤作用、抗氧化、抗衰老、消化系统保护作用的生物学效应外, 还有抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗辐射、抗凝血等作用。

1、基本原则在不破坏多糖活性的前提下进行多糖的分离纯化。

尽量不引入新的杂质, 或引入的新杂质易于除去, 如小分子盐类可经过透析作用除去, 铵根离子可经过加热挥发除去等[1]。

2、分离纯化方法多糖的生物活性倍受关注, 但不少多糖的提取方法和工艺尚未成熟, 基于效率、成本多方面的考虑, 各种方法的开发、比较、分析是研究工作的焦点之一。

当前多糖提取方法主要有溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法、超滤法、超声法、微波法、超临界流体萃取法。

首先要根据多糖的存在形式及提取部位不同, 决定在提取之前是否做预处理: 提取时需注意对一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类, 在用水提取前, 应先加入甲醇或l: l的乙醇乙醚混合溶液或石油醚进行脱脂, 而对含色素较高的根、茎、叶、果实类, 需进行脱色处理。

2.1多糖的提取与分离方法由于各类多糖的性质及来源不同, 因此提取方法也各有所异, 主要归纳为以下几类:第一类难溶于水, 可溶于稀碱液的主要是胶类, 如木聚糖及半乳糖等。

原料粉碎后用0.5mol/L NaOH水溶液提取, 提取液经中和及浓缩等步骤, 最后加入乙醇, 即得粗糖沉淀物。

第二类易溶于温水, 难溶于冷水的多糖, 可用70~80℃热水提取,提取液用氯仿: 正丁醇( 4:1) 混合除去蛋白质, 经透析、浓缩后再加入乙醇即得粗多糖产物[2]。

第三类粘多糖的提取。

在组织中, 粘多糖与蛋白质以共价键结合, 故提取时需设法破坏粘多糖与蛋白质之间的结合键。

一般使用蛋白酶水解蛋白部分或碱处理, 使粘多糖与蛋白质之间的结合键断裂, 以促进粘多糖的释放以便于提取[3]。

( 1) 碱液提取法: 本法的主要依据是蛋白聚糖的糖肽键对碱不稳定。

原料经预处理后用0.5mol/L NaOH溶液4℃提取, 提取液用酸中和。

蛋白质可用调pH、加热、或用白陶土吸附法除去。

最后以乙醇沉淀即可获得成品。

从软骨中提取软骨素即用此法。

( 2) 蛋白水解酶消化法: 从组织中释放出粘多糖的方法, 经常使用的是蛋白水解酶进行消化。

一般应用专一性低的蛋白酶如木瓜蛋白酶及链霉素以进行广泛的蛋白质水解。

经酶消化后的提取液中主要还有低分子量得蛋白消化产物及残存蛋白等杂质。

蛋白质可用5%三氯醋酸沉淀去除, 小分子的杂质可用透析法去除。

最后加入乙醇可得粘多糖沉淀。

2.2多糖的除杂质蛋白质的去除, 经过水提所获得的粗多糖常含有较多的蛋白质。

采用醇沉或其它溶剂沉淀得到的粗多糖中常含有较多的蛋白质, 需要除蛋白。

除蛋白的方法传统上有sevage法、三氯乙酸法、酶解法、三氟三氯乙烷法等。

三氯乙酸法去除蛋白率高, 但多糖在三氯乙酸中不稳定, 糖苷键易断裂, 故多糖损失率也较高。

鞣酸法蛋白去除率较低, 可是此种方法是利用鞣酸与蛋白质的特异性反应, 不会造成多糖的损失。

Sevag 法蛋白去除率最高,可是由于此法使用的试剂是氯仿和正丁醇,而氯仿是有毒物质,容易造成多糖活性下降和溶剂残留。

另外, 有机溶剂与去蛋白酶结合的除蛋白法也常被用在实验研究中, 其效率更高, 更加节省试剂和资金。

为了避免使用有机溶剂可采用重复冻融的方法除蛋白。

色素的去除, 植物多糖提取物中含有酚类化合物,在多糖提取过程中由于氧化作用会有色素生成, 色素的存在会影响多糖的色谱分析和性质测定。

常见的脱色方法有: 吸附法(DE．AE纤维素、硅藻土、活性炭等)、氧化法(过氧化氢)、离子交换法。

除小分子杂质, 小分子杂质如低聚寡糖的残留往往影响多糖的生物活性, 需要进一步脱除, 提高纯度。

传统的方法是透析法, 该法操作简单、技术成熟, 但周期长, 往往需要2 d-3 d, 常温下操作有可能造成多糖的霉变, 必要时需加入少量防腐剂或需在低温条件下进行。

随着膜分离技术的发展, 纤维滤器透析法已经发展起来了, 它利用不同孔径的膜使大小不同的分子分级, 这种方式可缩短生产周期, 而且条件温和, 无疑是多糖脱除杂质的一条新途径。

2.3多糖的纯化方法多糖的纯化方法很多, 须根据条件适当选择。

必要时可使用多种方法以达到理想的分离结果 1.分级沉淀法用乙醇进行分级分离是分离多糖混合物的经典方法, 并且适用于大规模分离。

该法往往需要多次重复进行才能达到较好的效果。

如从肝素生产废弃物中分离纯化硫酸皮肤素[4]。

分级沉淀有机试剂的筛选有机试剂沉淀法作为纯化生物大分子物质的一种经典方法, 选择有机溶剂时应能和水混溶, 使用较多的有机溶剂如乙醇、丙醇、丙酮等, 为避免生物活性大分子变性失活, 沉淀应在低温下进行。

分别选取乙醇、丙醇和丙酮作为沉淀剂, 取预处理后的样品按固液比1∶10 溶解于去离子水中, 加入0.1V 体积的沉淀剂, 摇匀20min, 4℃密封静置24h。

离心1 r /min, 20min, 4 ℃, 取出沉淀并用20mL 去离子水冲洗、冻干。

再向上清液中加入0.1V 原溶液体积的沉淀剂, 重复上述操作, 直至加入沉淀剂时连续 5 次无沉淀产生。

取各次沉淀溶解后进行醋酸纤维素薄膜电泳检测。

2.季铵盐络合法粘多糖的聚阴离子与某些表面活性物质, 如十六烷基三甲基溴化铵中的季铵基阳离子结合生成季铵络合物。

这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶解。

当离子强度增大时, 这些络合物能够解离并溶解。

本法的优点是既适用于实验室又适用于生产。

季铵盐及其氢氧化物是一类乳化剂, 可与酸性糖形成不溶性沉淀, 常见于酸性多糖的分离。

当溶液的pH值增高或加入硼砂缓冲液使糖的酸度增高, 也会与中性多糖形成沉淀。

常见的季铵溴化物(cetyltri．methyl ammonium bmmide, cTAB)及其氢氧化物(cetyl t methyl amm0nium hydr(Jxiode, CTA一0H)和(certylpyridium hydroxide, CP一0H), 其浓度一般为1％～10％ (W／V), 它们可在酸性、中性、微碱性和碱性中分级沉淀分离出酸性多糖。

3. 柱层析法3.1凝胶柱层析法: 常见的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼脂糖凝胶(Sepharose), 以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂, 使各种多糖得以分离纯化, 但不适宜粘多糖的分离。

3.2离子交换层析常见的交换剂为DEAE-纤维素、DEAE-葡萄糖凝胶(DEAE—Sephadex)、DEAE-琼脂糖凝胶(DEAE-Sepharose), 此法适用于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。

最常见的是DEAE-纤维素在pH为6时酸性多糖吸附于交换剂上, 中性多糖不吸附, 然后用逐步提高盐浓度的洗脱液进行洗脱进而达到分离。

它一方面可纯化多糖, 另一方面还可分离各种多糖。

如川芎多糖的分离纯化[5]: 纤维素柱水平衡后, 取200mg粗多糖样品溶解于蒸馏水中上样, 蒸馏水洗脱70ml后, 以0～3mol/l NaCl溶液梯度洗脱, 流速1.0ml/min, 每管收集2ml, 硫酸－苯酚法显色检测。

凝胶柱层析和离子交换层析往往在分离纯化过程中交替使用, 以达到更好的分离纯化效果。

如灰树花多糖GFP75-2-2B[6]的分离:4.超滤法采用中空纤维超滤膜, 对多糖去蛋白质后的提取液经过超滤去除小分子杂质5.色谱法色谱法是常见的纯化多糖的方法, 包括离子交换色谱和凝胶色谱, 色谱法是利用填料对不同种类的糖吸附作用的差异, 使混合物中各糖分达到彼此分离的方法。

逆流色谱( Countercurrent chromatography, CCC) 技术是一种无固体载体的连续液—液分配色谱技术, 其固定相经过重力场和离心力场作用被保留在分离柱内, 流动相与固定相在色谱仪内进行分配, 而达到物质的分离。

逆流色谱与传统色谱相比具有无死吸附、进样量大、分离纯度高等显著的优势, 在食品、生物化工、制药等领域具有广阔的应用前景。

在海带多糖[7]的分离纯化中使用了该技术。

用泵把固定相从进口注入HSCCC分离柱中, 待固定相充满后, 开动主机, 调节转速达到预定转速并稳定后, 用20ml固定相溶解0.15g精制多糖, 用恒流泵将样品溶液以一定流速注入HSCCC, 部分收集器收集。

分离完成后, 停止转动。

用气泵使HSCCC中的液体流出。

使用了逆流色谱分离多糖的双水相系统, 在PEG1000浓度为12%, KH2PO4浓度为8%, K2HPO4 浓度为8%, 转速在400r/min时, 能够使海带多糖达到很好的分离。

下图为逆流色谱仪示意图。

6.制备性区带电泳根据各种多糖的分子大小, 形状及其所带电荷的不同可用电泳法进行分离。

7.固定化凝集素的亲和层析法近年来根据凝集素能专一地、可逆地与游离的和复合糖中的单糖和寡糖结合的性质, 利用固定化凝集素亲和层析作为分离纯化糖蛋白的方法。

这一方法简单易行, 在温和条件下进行不破坏糖蛋白活性。

固定化的刀豆凝集素( concanavalin A, Con A) 是应用最普遍的固定化凝集素。

Con A能专一地与甘露糖基结合, 各种的酶如α-和β-半乳糖苷酶、过氧化氢酶、干扰素等都可用固定化Con A纯化。

8.膜分离法膜分离具有无相变及化学变化、可常温操作、选择性高与能耗低等优点。

如马尾藻多糖就采用了膜分离纯化技术。

海藻多糖是一类组成相当复杂的生物大分子, 使用膜分离技术对海藻多糖[8]进行分级可达到初步纯化的目的。

在压力0．5MPa, 温度20℃条件下, 将脱蛋白之后的提取液稀释至1 L, 先用孔径0．1 μm 的微滤膜过滤, 分成浓缩液和透过液, 将透过液依次用截留分子量为100、 50、 10、 3kD 的超滤膜进行超滤, 分别收集浓缩液和透过液。

近20 年来, 由于分子生物学的发展, 人们逐渐认识到糖及其复合物分子具有极其重要的生物功能, 快速高效、节省能源、简便易行的提取与纯化工艺对多糖的研究有重要意义。

多糖在自然界植物中广泛存在, 但由于其种类的多样性、结构组成的复杂性以及多糖分子量大、极性大等特点, 给植物多糖提取、分离带来很大困难, 要想获得较高的多糖提取率, 用单一的提取方法不一定能取得理想的效果, 将2种或者多种提取方法结合可能得较好的提取效果[9]。

在多糖的分离、纯化中常见分级沉淀法、纤维素柱色谱法和凝胶色谱法相结合的方法进行分离、纯化, 使多糖的分离、纯化能达到理想的效果。