课程设计说明书不同分子量聚谷氨酸制备条件研究学院（系）年级专业：学号：学生姓名：指导教师：教师职称：2013-2014 春季学期生物工程专业课程设计结题论文不同分子量聚谷氨酸制备条件研究学院（系）：年级专业：学号：学生姓名：指导教师：教师职称：摘要.γ-PGA 是一种有极大开发价值和前景的多功能性生物制品，近年来被作为增稠剂，保湿剂，药物载体等而一直被广泛应用于工业领域。

它是一种水溶性和可生物降解的新型生物高分子材料，可通过微生物合成。

在生产低聚谷氨酸工艺当中，利用微生物发酵法生产聚谷氨酸具有很好的前景，但在利用微生物发酵法制备产物时，生产的聚谷氨酸具有较大的分子量，需要对其进行进一步的降解处理。

本设计拟对微生物发酵生产的高分子量的聚谷氨酸进行降解，并优化其降解条件，从而得到不同分子量的低聚谷氨酸分子，并利用琼脂糖凝胶电泳和高效液相凝胶色谱检测其降解后的分子量，从而确定最佳降解条件。

本设计主要分为三个部分对不同分子量的γ-PGA 的制备情况进行了研究。

第一部分是通过微生物发酵，提取得到 80-100 万分子量的大分子聚谷氨酸产物的设计；第二部分根据聚谷氨酸分子特性，设计筛选可降解大分子聚谷氨酸的方法，并优化降解条件，得到不同分子量的低聚谷氨酸分子，并找到合适的方法进行分离纯化；第三部分是在前两部分的基础上，通过建立琼脂糖凝胶电泳和液相凝胶色谱检测不同分子量低聚谷氨酸的方法，从而设计出最佳的制备条件。

关键词：生物发酵法、聚谷氨酸、降解条件、检测方法目录第一部分文献综述 (3)1.1 γ-聚谷氨酸简介 (3)1.2 聚谷氨酸结构 (3)1.3 聚谷氨酸性质： (4)1.3.1 吸水特性 (4)1.3.2 生物可降解性 (5)1.3.3 γ-PGA 的水解特性 (5)2. γ-PGA 的应用前景 (5)2.1 γ-PGA 的应用 (5)2.1.1 聚γ-PGA 是一种微生物絮凝剂 (6)2.1.2 γ-PGA作为一种新型的高分子吸水性材料 (6)2.1.3 γ-PGA作为新型的药物载体 (6)3. γ-PGA 合成方法 (7)3.1 化学法合成 (7)3.1.1 传统的肽合成法 (7)3.1.2 二聚体缩聚法 (7)3.2 提取法合成 (8)3.3 微生物生物合成法 (8)3.3.1 代谢途径 (8)4. 研究进展 (8)5. 总结——本设计的前景分析以及研究意义 (9)5.1 前景分析 (9)5.2 研究意义 (10)1.材料 (12)1.1 实验原料和试剂 (12)1.2实验器材 (12)2. 方法 (13)2.1 微生物培养方法 (13)2.1.1 平板培养 (13)2.1.2 种子培养 (13)2.1.3 摇瓶发酵 (13)2.2 γ-PGA的纯化方法 (13)2.2.1 菌体的分离 (13)2.2.2 乙醇沉淀 (13)2.2.3 丙酮分级沉淀 (13)2.2.4 透析袋透析除盐 (13)2.2.5 硅胶薄层层析 (14)2.3 生理指标的测定方法 (14)2.3.1 生物量测定 (14)2.3.2 细胞数测定 (14)2.3.3 分子量分析 (14)2.3.4 粘度的测定 (15)2.3.5 pH 稳定性的测定 (15)2.4 碳源试验 (15)2.5 氮源试验 (15)2.6 前体物质L-谷氨酸试验 (16)2.7 碳源、氨源、前体物质正交试验 (16)2.8 无机离子正交试验 (16)3 .1培养基营养成分对聚谷氨酸分子量影响的设计 (16)3.1.1 培养基中不同碳源对聚谷氨酸分子量影响的设计 (16)3.1.2 培养基中不同氮源对聚谷氨酸分子量影响的设计 (17)3.1.3 培养基中前体谷氨酸对聚谷氨酸分子量影响的设计 (17)3.2 培养基中碳源、氨源、前体物质正交试验的设计 (17)3.3 不同pH 对不同分子量聚谷氨酸影响的设计分析 (17)4. 设计分析 (17)4.1 培养基营养成分对聚谷氨酸分子量影响的设计 (17)4.1.1 碳源对产物Γ-PGA分子量合成的影响的设计分析 (17)4.1.2 培养基中不同氮源对聚谷氨酸分子量影响的设计分析 (18)4.1.3 培养基中前体谷氨酸对聚谷氨酸分子量影响的设计 (18)4.2 培养基中碳源、氨源、前体物质正交试验的设计 (18)4.3 不同pH 对不同分子量聚谷氨酸影响的设计分析 (18)5 总结体会 (19)参考文献 (21)第一部分文献综述1.概况背景1.1 γ-聚谷氨酸简介γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种由微生物生物合成的聚谷氨酸，它由 D-谷氨酸单体或L-谷氨酸单体以羧基和氨基相缩合而成[1]。

在生物体内γ-PGA 生物相容性良好，可以降解为谷氨酸而直接被生物体吸收，对于用作生物医用材料有明显优点。

另外，主链上有大量游离羧基存在，使γ-PGA 具有水溶性聚羧酸的性质，如强吸水和保湿性能，可用于化妆品、食品、分散剂、螯合剂、建筑涂料、防尘等领域[2-3]。

这些活性位点为材料的功能化提供了条件。

由于其良好的环境友好性，在注重环保强调可持续发展的今天，这种来自生物的可降解型功能材料受到人们的青睐。

1.2 聚谷氨酸结构对γ-PGA 的氨基酸组分分析表明，该物质只有谷氮酸一种氨基酸组成，其纯化样品在 216 nm 处有吸收峰，与典型蛋白质吸收峰不同。

γ-PGA 经硅胶层析后，用不同官能团显色剂处理，α—萘酚、间苯二酚、甲基苯二酚反应呈阴性，双缩脲反应阴性而茚三酮反应阳性，该物质没有典型的肽链结构，也不是一种环状多肽。

随着温度的提高，γ-PGA 水溶液在一定的温度范围内粘度变化不大，聚合物结构较稳定。

在高温下，粘度下降快．γ-PGA 水解也很快，分子量逐渐变小，γ-PGA 的水解是由链的随机切割引起的。

不同生产方式得到的γ-PGA 的分子量有差异，如采用地衣芽孢杆菌摇瓶发酵得到的γ-PGA 的分子量为1.06 × 105 Da，而通过 5 L 发酵罐生产的γ-PGA 的分子量为 2.47 × 105 Da。

γ-PGA 的等电点为 3.47，它是一种酸性氮基酸聚合物。

1.3 聚谷氨酸性质：1.3.1 吸水特性由于γ-PGA 极易溶于水，因此其具有很好的吸水特性，王传海等对γ-PGA的吸水性能进行了研究，结果表明，γ-PGA 的最大自然吸水倍数可达到 1108 倍，比目前市售的聚丙烯酸盐类吸水树脂高 1 倍以上，对土壤水分的吸收倍数为 30-80 倍。

γ-PGA 的水浸液在土壤中具有一定的保水力和较理想的释放效果，有明显的抗旱促苗效应。

在0.206 mol / L浓度的 PEG(6000)模拟渗透胁迫条件下，γ-PGA 仍有较强的吸水和保水能力，可明显提高小麦和黑麦草的发芽率，用其直接拌种也能显著提高种子的发芽率[5]。

γ-PGA 的吸水性和保水性可使γ-PGA 被广泛应用于干旱地区保水以及沙漠绿化。

1.3.2 生物可降解性生物可降解性是γ-PGA 的特性之一。

所有γ-PGA 产生菌株都可以以γ-PGA 作为营养源进行生长。

在培养液中存在一种与γ-PGA 降解有关的解聚酶。

其它自然菌株也具有降解γ-PGA 的能力。

以γ-PGA 作为唯一碳源和氮源对可降解γ-PGA 的菌株进行筛选，结果筛选出至少 12 株可降解γ-PGA 的菌株[6]。

由此可知，发酵生产γ-PGA 的培养时间对产量有较大的影响，时间过长会导致γ-PGA 分子被酶解而损失。

1.3.3 γ-PGA 的水解特性γ-PGA 的水溶液在 10 mL、浓度为 6 mol / L的 HCl 中，抽真空封口，105 ℃ 的烘箱的条件下可以水解为谷氨酸，吕莹等[7]的研究表明，水解 17 h、25 h、48 h的结果一致。

此特性可用于γ-PGA 纯度的测定。

2. γ-PGA 的应用前景2.1 γ-PGA 的应用γ-PGA是一种天然存在的水溶性的聚合氨基酸，具有生物可降解性，可食用且对人体和环境无毒害。

近年来其被作为生物絮凝剂，增稠剂，加湿剂，药物载体，药物缓释剂，生物可降解纤维，高吸水性树脂，重金属吸收剂以及食品添加剂等一直被广泛应用于工业领域如食品工业，药物工业，化妆品工业及污水处理中，是一种有极大开发价值和前景的多功能新型生物制品。

2.1.1 聚γ-PGA 是一种微生物絮凝剂γ-PGA可以用作饮用水、废水、发酵食品工业下游过程溶液的生物絮凝剂以及重金属或放射性物质螯合剂，用于回收金属盒减少环境污染等。

2.1.2 γ-PGA作为一种新型的高分子吸水性材料近年来，人们把水溶性高分子作为精细化工的骨干产品之一，越来越受到人们的重视。

它的应用范围几乎涉及人所能涉及的任何领域。

随着高分子材料的快速发展，在其重要性日益突现的同时，人们发现了它的不足之处，即大部分的人工合成的高分子材料在自然界难以降解。

在人们越来越关心自己生存环境的今天，不可降解的高分子材料造成的“白色污染” (如聚乙烯、聚丙烯等)，也越来越受到人们的关注。

为了解决这个问题，人们开展了各种研究工作。

制成了各种可生物降解材料[8]。

在日本，聚谷氨酸得到广泛应用，主要以谷氨酸γ-甲基酯为基础，生产新型聚合物IITC。

此类聚合物可以用来制造皮革、纤维、食品包装膜等。

聚合 D-谷氨酸用苯乙烯改性后，可得到高抗碱性的纤维树脂。

若通过改性再聚合，可得到比一般天然纤维和化学纤维更优的材料，如外科手术的缝合线，就是以氨基酸和羧酸为基础，由易水解纤维状和薄膜状的聚合物制得的。

而渗透杀菌剂、防腐剂、抗生素的聚合氢基酸对伤口和皮肤病还有防治作用。

以谷氨酸和烷基谷氨酸酯的共聚物为基础，研制出来的聚合物是药品很好的包裹材料，可作胶囊或糖衣片。

日本九州大学原敏夫等人通过大豆发酵，提取γ-PGA，用电子柬照射，制成γ-PGA 树脂，这种物质呈白色粉末状，具有极强的吸水性，其吸水性能是纸和尿不湿的 5 倍。

γ-PGA 吸水饱和后，呈凝胶状，可包裹在植物种子的表面上作为种子的理想包衣材料。

原敏夫认为，这种树脂是沙漠绿化的好武器，并提出了中国绿化沙漠的设想(原敏夫特开平)。

另外，γ-PGA 作为一种凝胶材料，也可以起分子筛作用2.1.3 γ-PGA作为新型的药物载体γ-PGA 具有良好的生物亲和性和生物降解性，作为药物载体可提供药物缓释性、靶向性，提高药物水溶性，降低药物不良反应，从而提高药物疗效。

（1）用作金属螫合物抗癌药物顺二氯二氨铂(CDDP)的载体该药物为重金属络合物，微溶于水，且在水中不稳定，疗效低，对细胞毒性大，用γ-PGA (相对分子量 4 × 104)作为药物载体，可形成有活性的、相对稳定的 CDDP-PGA 复合物，该复台物有较高的动力学稳定性和对正常细胞较低的毒性，有利于 Pt2+ 对配体的亲和，而且其治疗剂量范围宽。