（5）残留菌体DNA分析——DNA杂交
非蛋白类杂质主要有: 病毒、细菌等微生物、热原、 内毒素、致敏源及DNA。
指标：≤10ng/mg
（6）残留菌体蛋白分析——ELISA法
超量的菌体蛋白会引起严重的过敏反应。
本实验采用抗大肠杆菌菌体蛋白抗 体和HRP－抗大肠杆菌菌体蛋白抗 体，经ELISA法测定。
指标： ≤0.1%
（7）生物活性测定
本实验检测目 的蛋白对成纤 维细胞是否有 增殖作用
Biological activity assay
（8）内毒素含量测定
内毒素：是多种革兰氏阴性菌的细胞壁成分，由菌 体裂解后释出的毒素，又称之为“热原”。
本实验主要考察纯化样品 （原液）本身对鲎试剂是否 有干扰，同时检测样品的内 毒素含量范围 （ ≤50EU/mg ）。
利用PCR扩增目的基因
2、重组载体的构建
目的基因
NdeI
SalI
目的基因与pET30a(+)连接重组
3、转化子筛选——（含卡那霉素的抗性平板）
4、工程菌的表达——IPTG诱导
目的蛋白条带
5、表达产物的纯化
目的蛋白（20 kD）
纯化后的蛋白电泳图谱
重组蛋白大规模制备工艺流程
6、产品的质量检测12 Nhomakorabea杂质和污染物
单克隆抗体 氨基酸取代 微生物 支原体 病毒
检测方法
SDS-PAGE、免疫分析 氨基酸分析、肽谱、质 谱、CE 微生物学检查 微生物学检查 微生物学检查
（1）纯度及分子量测定
SDS-PAGE检测分子量
HPLC检测纯度
14
（2）原液肽图分析
对照品肽图 原液肽图
（3）等电点分析
（4）Western-blotting分析
⒋构建高表达工程菌
⒌工程菌发酵（发酵工艺建立）
⒍产物的分离纯化（纯化工艺建立） 下游技术
⒎产品的检验等（质量标准的建立）
5
二、基因工程药物生产实例
1、目的基因克隆
本实例中，以生 产某一表皮细胞 生长因子为例 （基因大小为： 513 bp，编码 170个氨基酸， 分子量大小为 19.3 kD)
1M
目的基因 （513 bp）
常用检测指标与方法：
杂质和污染物
内毒素 宿主细胞蛋白 其它蛋白杂质 残余DNA 蛋白变异 甲酰蛋氨酸 蛋氨酸氧化 产物变性或聚和脱氨基
检测方法
鲎试剂、家兔热原法 免疫分析、SDS-PAGE、CE 免疫分析、SDS-PAGE、 HPLC、CE DNA杂交、紫外光谱、蛋白结合 肽谱、HPLC、 IEF、 CE 肽谱、HPLC、 IEF、 CE 肽谱、HPLC、 质谱、氨基酸分析 SDS-PAGE、IEF、HPLC、 CE、质谱、 凝胶过滤
Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery
一、回顾一下基因工程操作步骤
1、重组DNA技术操作步骤
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建
外源基因与载体的连接 DNA导入受体菌
重组体的筛选
克隆基因的表达
基因工程药物生产
胰岛素、生长激素、干扰素、白细胞介 素、乙肝疫苗、单抗、表皮生长因子等五十 余种药物，通过基因工程实现工业化生产， 均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平 发挥了重大的作用。
基因工程药物的高回报
• 碱性成纤维细胞生长因子 231元/g
• 红细胞生成素
1072元/ g
• 白细胞介素-2
410元/ g
• 巨细胞粒细胞集落刺激因子 1960元/ g
• 胰岛素
10.2元/mg
基因工程药物制备的主要程序:
⒈目的基因的克隆
⒉构建DAN重组体 ⒊DAN重组体转入宿主菌
上游技术
课后问题?
大家查一下如何测定原液中的蛋白浓度? 有哪 几种方法可以测定?
谢谢聆听！