三、特点
1. 2. 3. 4. 5. 生物体的基本生化成分 分子量大: 分子量测定 结构难确证 全过程的质量控制：原料、生产过程、 最终产品 生物活性检查
6. 7.
安全性检查 效价（含量）测定： 理化法：有效成分的含量 效价测定和酶活力测定：有效成分 的生物活性
四、生物制品的全程质量控制
• • • • 有效成分的同一性、结构确证 有效成分的均一性、纯度检验 有害物质及残余杂质等的控制 高效灵敏的生物活性及比活性等试验方 法
1.化学鉴别法：
药物 + 试剂 现象 颜色 沉淀
例：溶菌酶 - COiNH- +Cu2+ 色
络合显
2.紫外分光光度法
例：三磷酸腺苷二钠 溶剂：0.01mol/L盐酸 浓度：20μg/ml 判断： λmax：257±1nm A250/A260：0.17～0.27。
3. HPLC法：
利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留 时间和肽图谱的一致性进行鉴别。
梯度洗脱 荧光检测器：ex=280nm～340nm,em=430nm
测定： 样品---肽 样品水解：5.7mol/L盐酸，0.1%苯酚、通N2， 110℃，20h ～24h。 样品干燥：真空 样品的衍生化：丹酰氯 水解剩余的衍生化试剂：0.4mol/L NaOH 进样测定
返 回
一、防病、治病的三大药源
化学药物 生化药物 药物 生物药物 中药 生物技术药物 生物制品
biochemical drugs
biopharmaceutics or biopharmaceuticals
biotechnology drugs biological products
1．生化药物：
动物 植物 微生物
提取 生物-化学半合成 现代生物技术
生命基本物质及 衍生物 降解物 大分子的结构修饰物
例：氨基酸、多肽、蛋白质、酶等。
2.生物合成药物
• 由微生物代谢所产生的 • 必须利用微生物及其酶转化反应共同完 成的半合成药物 例：抗生素、生物碱、甾体激素、维生素、 酶及辅酶类药物
3.生物制品
2.特异性毒性检查 • 主要检查某些疫苗类生物制品是否存在 自身毒素引起的特异性毒性的不安全因 素 • 一般选择小鼠或豚鼠试验
㈤过敏反应检查 • 将一定量的供试品溶液诸如豚鼠腹腔或 皮内，间隔一定的时间后静脉或皮内注 射供试品进行攻击，观察动物是否出现 过敏反应的情况，以判断供试品是否引 起动物全身的过敏反应 • 过敏反应是检查异性蛋白的试验方法 • 例子
㈢高效液相色谱法 • 具有高效分析、灵敏检测、操作简便的 优点 • 分离过程中不破坏分离样品的特点 • 适合于对高沸点、大分子、强极性和热 稳定性差的生物制品的定量分析
1）RP-HPLC：柱前衍生化自动测定氨基酸
柱：RP—18， 柱温：48℃
流动相：A--0.05% TFA；B--乙腈-异丙醇（4：1）
第十三章 生化药物和基因工程药物 分析概念 • 基本要求 • 概述 • 质量检验的基本程 序与方法 • 常用定量分析方法 及其应用 • 练习与思考
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基本要求
1．了解生化药物的定义、生化药物分析 的特点、生化药物分析的进展 2．熟悉生化药物分析的方法 3．掌握常用定量分析方法（酶法、电泳 法、生物检定法、理化法）的基本原理
第四节 含量（效价）测定
生化药物和基因药物的含量表示方法： 百分含量：适用于结构明确的小分子药 物或经水解后变成小分子的 药物。 生物效价或酶活力单位：适用于酶类、 蛋白质类药物。
含量测定方法：
理化分析法： 化学分析法：重量测定法、滴定分析法 电化学分析法 光谱分析法：比色法、紫外分光、荧光分光光法 色谱分析法：HPLC法：RP-HPLC、 HPIEC 、HPGFC、 灌注色谱法、HPCE法 酶法：酶活力测定法、酶分析法 电泳法 生物检定法
3.血液制品
• 由健康人的血液或经特异免疫的人血浆， 经分离提纯或者重组DNA技术制成的血 浆蛋白组分，以及血液细胞有形成分， 统称为血液制品 例如： 人血白蛋白、人免疫球蛋白、破伤风 人免疫球蛋白等
4.重组DNA制品
• 采用遗传修饰，将所需的编码DNA通过 一种质粒或病毒载体，引入适宜的微生 物或细胞系，DNA经过表达翻译后成为 蛋白质，再经提取和纯化而回收所需制 品制得。 • 宿主细胞：转染载体前的细胞和微生物 • 宿主-载体系统：用于生产过程中两者稳 定的结合
• 以微生物、细胞、动物或人源组织和体 液等为原料运用传统技术或现代生物技 术制成 • 用于人类疾病的预防、治疗和诊断 例如：细菌类疫苗、病毒类疫苗、抗毒素、 抗血清、生长因子、单克隆抗体等
DNA重组技术（基因工程）：生产过程为
天然基因 合成的核 苷酸序列
内切酶 载 连接酶 体
重组 的遗 传物 质
2. 电泳法：以肝素鉴别为例。
O CO O O OH O SO 3 O O HNS O 3 C H2O SO 3 O
与国家肝素标准 体外的抗原抗体试验。 • 经典血清学反应： 凝集反应、沉淀反应、中和反应和补给结 合反应 • 免疫扩散、免疫电泳以及荧光标记、酶 标记等高敏感的检测技术
例如:
• 破伤风抗毒素的鉴别 • 人血白蛋白的鉴别 • 重组人白介素-2的鉴别：免疫印记法、 免疫斑点法
2. 生物法：
利用生物体进行试验来鉴别药物。 例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。
利用胰岛素的降糖作用。给家兔大剂量注
射胰岛素，家兔惊厥，迅速静注50%GS，惊厥
停止。
第三节 杂质检查
• 一般杂质检查 •特殊杂质检查：原料药纯度分析 生产和贮存过程中杂质的检查 • 安全性检查
• 体外诊断制品：由特定抗原抗体或有关 生物物质制成的免疫诊断试剂或诊断试 剂盒。 如：伤寒、副伤寒诊断菌液，沙门氏菌诊 断血清，HBsAg酶联免疫诊断试剂盒等 • 体内诊断制品：由变态反应原或抗原材 料制成的免疫诊断试剂 如：卡介菌纯蛋白衍生物等
6.其他制品
• 由有关生物材料或特定方法制成，不属 于以上5类的其他生物制剂，用于治疗 和预防疾病 例如： 胰岛素、胃蛋白酶、核酸制剂等
一、特殊杂质的检查
• 生物污染： 微生物污染、细胞成分、培养基成分 • 产品相关杂质 二聚体、多聚体、脱氨或氧化产物、突变 物、错误裂解产物、二硫化物异构体等 • 工艺添加剂 残余抗生素、乙醇、佐剂氢氧化铝等
㈠宿主细胞（菌）蛋白残留量的检查
• 与生物制品生产用的细胞、工程菌相关 的特殊杂质 • 控制异源蛋白的含量以防超量后引起机 体的免疫反应 • 特别对于临床使用中反复多次注射的药 品
酶联免疫吸附法（ELISA）
• 原理 • 试验方法
㈡外源性DNA残留量的检查
• 分子杂交技术 • 基于DNA结合蛋白（threshold）分析系 统 • 实时定量PCR(Q-PCR)的方法
1.分子杂交技术 • 基于DNA探针检测变性而且固定在硝酸 纤维素膜上的宿主细胞DNA。 • 杂交 • 标记探针-地高辛 • 灵敏度是10pg以下
二、生化鉴别法 1.酶法：
例：尿激酶的鉴别---气泡上升法
原理：
尿激酶 牛纤维蛋白溶酶原
牛纤维蛋白原
牛凝血酶
蛋白结块
结块溶解： 气泡上升
方法：
取小试管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纤 维蛋白原溶液，再依次加入牛纤维蛋白溶酶原 溶液、牛凝血酶溶液，迅速摇匀，立即臵 37℃±0.5℃恒温水浴保温，记时。反应系统在 30～40秒内凝结，凝结块内有气泡生成，15分 钟内凝结块溶解，当凝结块溶解时，气泡逐渐 上升。以0.9%氯化钠作空白，同法 操作，凝结 块在2小时内不溶。
二、安全性检查
㈠无菌检查 1.基本步骤： • 培养基的制备 • 菌种的选择 • 具体检查 • 结果判断 2.注意事项
㈡热源检查 1.原理 2.检查法 3.结果判断
㈢细菌内毒素的检查 • 凝胶法和光度法，当出现争议时，以凝 胶法为准
㈣异常毒性的检查和特异性毒性检查 1.异常毒性检查 • 生物制品的非特异性毒性的通用安全试 验，检查制品中是否污染外源性毒性物 质以及是否存在意外的不安全因素 • 试验包括小鼠试验和豚鼠试验 • 药典中规定的异常毒性试验，实际上是 一种限度试验
⑵病毒类疫苗 由病毒，立克次体或其衍生物制成的 减毒活疫苗、灭活疫苗、重组DNA疫苗、 亚单位疫苗等 例如： 流感全病毒灭活疫苗、重组乙肝炎 疫苗等
⑶联合疫苗 两种或两种以上疫苗原液按一定的比例配 合制成的具有多种免疫原性的灭活疫苗 或活疫苗 例如： 伤寒副伤寒甲乙联合疫苗等
⑷双价及多价疫苗 由单一型抗原成分组成的疫苗称为单价疫 苗。由两个或两个以上同一种但不同型 抗原合并组成的含有双价或多价抗原成 分的疫苗，则分别称为双价疫苗和多价 疫苗 例如：双价肾综合征出血热灭活疫苗
• • • • • •
细胞因子类：重组人干扰素等 生长因子类：重组人表皮生长因子 激素类：重组人生长激素，重组人胰岛素 酶类：重组链激酶 疫苗：重组乙型肝炎疫苗 单克隆抗体：注射用人T细胞CD3鼠单抗
5. 诊断制品
• 用于检测相应的抗原、抗体或机体免疫 状态的制品 如：毒素、诊断血清、分群血清、分型血 清等
㈣残余抗生素的检查
• 中国药典（2005年版）三部附录ⅨA抗 生素残留量检查法可以检测残余氨苄西 林或四环素的活性 • 依据在琼脂培养基内抗生素对微生物的 抑制作用，比较对照品与供试品对接种 的试验产生的抑菌圈的大小，检查供试 品中氨苄西林或四环素的残留量
• 检查方法 • 结果判定 • 注意事项
2.基于DNA结合蛋白（threshold）分析系 统 • 基于两种DNA序列非特异性蛋白 -----单链DNA结合蛋白和抗ssDNA的单抗
• 过程
生物素-DNA单链结合蛋白和尿素酶-抗 ssDNA的单抗与变性的宿主细胞DNA结合，形 成复合物； 通过亲和素将这种复合物连接到生物素硝酸纤维素膜； 通过洗涤去除未结合的非特异性蛋白； 最后将生物素-醋酸纤维素膜臵于有尿素 溶液的读数仪，尿素酶催化尿素为NH3和CO2导 致溶液的PH 的变化，读数仪根据此变化推算 出外源性DNA的浓度