荧光定量PCR实验操作SOP
一、 实验目的：通过本操作获得准确、无误差、客观的样品基因扩增数据，用于下一步实验结
果的分析；
二、 实验准备：
A.进行荧光定量PCR实验操作之前，荧光定量PCR操作实验室需紫外灯照射15分钟，关闭
紫外灯后开启通风系统抽风15分钟。

B.进入荧光定量PCR操作实验室后需要佩戴一次性无菌口罩、无菌乳胶手套、实验中尽量避
免与同事交谈，防止PCR模板污染；
C.实验前将70%乙醇涂布于操作台及器具（移液器等）表面，两分钟后用纸巾擦除。

D.准备实验中放污染材料的器皿、用于荧光定量PCR实验操作的耗材（要求无菌）1ml 枪头、
200ul枪头、10ul枪头、1.5ml离心管，用荧光定量PCR操作的试剂: 荧光定量PCRMaster Mix、Taqman Probe（实验前预先稀释浓度至25pmol）、H2O，DNA或CDNA模板（注意
必须在配置完荧光定量PCR所需MIX后才可以取出）；
E.一个实验区域在同一时间段只进行一种实验。

F.实验结束后移出个人专用材料（实验记录本）至个人专用区域保管；封好污染材料盛放器
皿并移出至污物袋；移出共用器具至专门区域保管；将70%乙醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后用纸巾擦除；打开紫外灯照射至少15分钟。

三、 实验步骤：
1、荧光定量PCR MIX的配置：在实验记录本上记录下要进行实验的样品内容、日期、探针名称、实验样品孔信息（无特殊要求每样品每基因均按照3倍平行孔实验），然后计算出所需MIX 体积，分别加入后混匀分装至PCR扩增板，单孔荧光定量PCR孔Master Mix内容如下：
Primer F: 0.5ul( 25pmol)
Primer R: 0.5ul(25pmol)
20×SYBER GREEN : 1.5ul
dNTP: 1ul(2.5mM)
10*Buffer(含Mg2+) 3ul
BT Taq: 0.5ul
H2O: 22ul
Total: 29ul
2、MIX配置好后混匀快速分装至PCR反应板，快速准确的将样品DNA/cDNA小心加入装有反应液体的反应管内，：
DNA/CDNA Template: 1ul(200ng)
荧光定量PCR 反应总体积：30ul
3、模板加好后, 盖紧盖子并做好标记, 写上编号（用防水笔书写）；
4、严格按照荧光定量PCR仪的操作手册启动机器，设置实验扩增程序（包含荧光定量PCR扩增程序、荧光定量PCR样品孔及探针激发荧光程序、反应孔体系程序），保存文件，最好以日期及样品名称命。

5、荧光定量PCR扩增仪应预热，时间不少于20分钟。

6、将反应管置于扩增仪上，开始扩增。

7、反应结束时停止实验程序，取出反应产物，如需进一步实验则－20℃保存；
8、扩增结果分析和定量按照操作手册进行，对三孔平行的实验结果必须首先判断其是否准确（孔间差异>0.5时应考虑舍弃该孔数据，），然后根据2－△△CT或标准曲线计算出各样品的浓度；
9、结果报告中应注明使用的实验方法、实验试剂、实验仪器及样品种类和样品量；
实验结束后应该严格按照荧光定量PCR仪的操作手册关闭机器、关闭电脑电源，移出个人专用材料（实验记录本）至个人专用区域保管；封好污染材料盛放器皿并移出至污物袋；移出共用器具至专门区域保管；。