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２百合ＭＤＨＡＲ序列分析 将克隆得到的保守区片段，３’端核廿醴序列和５’端核心酸序列拼接．扶得了百台单脱氢
抗坏血酸还帐酶摹州ＭＤＨＡＲｌ５０２ｂｐ的全Ｋ ｅＤＮＡ．５＋ＵＴＲ和ｙＵＴＲ分别为２６ｂｐ和１７ｌｂｐ，
包青一个１３０５ｂ口的开放瞄读框（ＯＲＦ）（嘲４），编码４３４个氰基酸。从氮基酸序列同源性
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｌｉｌｉｕｍ ｌｏｎｇｉｆｏｒｕｍ；ｍｏｎｏｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂａｔｅ
ｒｅｄｕｅｔａｓｅ ｇｅｎｅ（ＭＤＨＡＲ）；Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
抗坏血酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ，ＡｓＡ）作为植物细胞内重要的自由基清除剂，是通过参与一系
列的氧化还原反应而发挥抗氧化剂的功能。单脱氢抗坏血酸还原酶（ｍｏｎｏｄｅｈｙｒｏａｓｃｏｒｂａｔｅ
ｔｈｅ ｒｏｏｔ，ｂｕｌｂ ａｎｄ ｌｅａｆ，ａｎｄ ｉｔ ａｘｐｒｃｓｓｃｘｔ ｈｉｇｈｌｙ ｉｎ ｔｈｅ
Ｗｆｌｑ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒａｉｓｉｎｇ ｏｆ
ａｎｄ ｌｅａｆ．Ｕｎｄｅｒ
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ｏｆＬＩＭＤＨＡＲ ｇｅｎｅ
Ｈ２０２
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．
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＋物技术
比较图谱可以看…（图５），百合与水稻和冰叫日中花的ｌ＿源性最高，分别达到８３％和８２％：
与人白菜和拟南芥的Ｉ可源性也分刖让到７６％，ｆ１１ ７４％。系统进化树分析也表明谈基Ⅲ与水稻
＿ｌ冰１１１日中花的亲缘笑系较近（图６），我ＨＪ将儿命名为ＬＩＭＤＨＡＲ。
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引物
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５＇－３’核酸序列Ｓｅｑｅｎｃｅ
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Ｆｌｚ ６Ｃｌｕｓｌｅｒｉｎｇ ｎｆｔｈｅ ｄｅｄ ｕｃｅｄ
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Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＭＤＨＡＲ ｆｒｏｍ Ｌｉｌｉｕｍ
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（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＯｒｎａｍｅｎｔａｌ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＭＤＨＡＲ）在抗坏血酸．谷胱甘肽循环中，可以将氧化型抗坏血酸（ＭＤＨＡ）还原 为还原型抗坏血酸（ＡＳＣ），在维持植物体内抗坏血酸的正常代谢和植物体氧化还原平衡方 面起着重要作用（Ｃｈｅｒｔ ２００３；Ｃｈｅｎ ２００５）。 百合作为主要的切花和盆花材料，在国内外花卉市场上占有重要地位。百合¨１ｅＩ ｐｌａｎｔｓ
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１．４百合ＭＤＨＡＲ基因３’端和５’端的克隆
根据已克隆的百合ＭＤＨＡＲ保守区片段，设计两条３’ＲＡＣＥ上游引物ＰＦ２和ＰＦ３，以 ＡＰｌ引物进行逆转录，以ＡＰ２为下游引物，进行巢式ＰＣＲ，对３’端进行扩增。反应程序为：
９４℃５ ｍｉｎ，９４℃４５ｓ，５２℃４５ｓ，７２℃ｌｍｉｎ，３５ｃｙｃｌｅ，７２℃延伸ｌＯｍｉｎ。
根据已克隆的百合ＭＤＨＡＲ保守ｆｘ．片段，设计３条５’ＲＡＣＥ下游引物ＰＲ２、ＰＲ３和ＰＲ４， 以ＰＲ２特异引物进行逆转录，对ｃＤＮＡ模板进行加尾反应，再以其为模板进行ＰＣＲ反应。 ＰＣＲ反应程序为：９４℃５ｍｉｎ，９４℃４５ｓ，５０℃４５ｓ，７２℃ｌｍｉｎ，３５ｃｙｃｌｅ，７２℃延伸１０ｍｉｎ。
表１引物序列
１．５序列测定 将所有ＰＣＲ产物凝胶电泳后同收目的片段，与ＰＭＤＩ ８－Ｔ载体连接夕ｉ：转化ＤＨ５ａ，重组 质粒鉴定后送北京华人基因公司进行测序。
１．６
ＲＴ－ＰＣＲ的表达分析 根据百合ＭＤＨＡＲ ｅＤＮＡ序列设计一对基闪特异引物ＭＤＨＡＲ．Ｆ和ＭＤＨＡＲ－Ｒ，以Ａｃｔｉｎ
基凶作为内参，采用半定量ＲＴ－ＰＣＲ方法研究ＭＤＨＡＲ在根、鳞苇、叶不同组织器官的表达
百合ＭＤＨＡＲ基因的克隆与表达分析
陈莉，辛海波，李晓艳，李晓昕，义鸣放・
（中国农业大学观赏冈艺与园林系，北京１００１９３） 摘要：采用ＲＡＣＥ技术，从铁炮百合‘白天堂’（‘ｗｈｉｔｅ ｈｅａｖｅｎ’）组培苗叶片中克隆得到一个单脱氢 抗坏ｍ酸还原酶摹因（ＭＤＨＡＲ）的ｃＤＮＡ序列，伞长１５０２ｂｐ，推断其编码４３４个氨纂酸。序列分析表明 该基因与其他植物的ＭＤＨＡＲ幕因具有较高的同源性。ＲＴ－ＰＣＲ表达分析表明，该基因在百合的根、鳞茎、 叶中均有表达，在根和叶中表达量较高。在Ｈ２０２氧化胁迫下，该幕因的表达量随着Ｈ２０２浓度的提高而增 加。 关键词：铁炮百合；ＭＤＨＡＲ；克隆：表达
模式，以及ｔｒｌ’片在０、Ｏ．５、５、５０、１００ｍＭＨ２０２溶液中处理ｌｈ后的表达情况。
２００９年中ｌ目球擞花卉年会空“【论文柴
生物技术
２结果与分析
２．１百合单脱氢抗坏血酸还原酶基因ＭＤＨＡＲ全长ｃＤＮＡ序列的克隆 以百合叫片攫取的ＲＮＡ逆转录的ｃＤＮＡ为模扳，以ＰＦＩ和ＰＲＩ为引物．进行保守隧的 ＰＣＲ扩增（圈Ｉ）．经剽序』￡核廿酸序列人小为９２０吣．剧源序列比对结粜显示，与水稻『目
润气候，越夏的百合经常出现生长停滞、植株低矮、花朵败育等现象，严重影响了切花质量，
并造成百合种球退化。夏季高温已成为限制国内百合周年生产的重要因素。 本研究采用ＲＡＣＥ技术从铁炮百合‘白天堂’叶片中克隆得到ＭＤＨＡＲ的ｅＤＮＡ全长， 并对其不同组织器官及氧化胁迫下时空表达特征进行了研究，为通过基因工程的方法提高植 物活性氧清除酶活性，从而提高植物的抗氧化胁迫能力，增强抗氧化代谢的水平，提高植物 的抗逆性提供理论依据。
源性逃７７％，与白菜ｌＨｉ！Ｉ＿性业７４％，与拟南芥剧源性选７２％，
２０００ｂｐ
２０００ｂｐ
０００ｂｐ ７５０ｂｐ ５００ｂｐ
１０００ｂｐ
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５００ｂＤ
２５０ｂｐ １００ｂｐ
２５０ｂｐ
ｌＯＯｂｐ
崮１ＭＤＨＡＲ基闻中问Ｊ｝段电泳目谢 Ｍ：ＤＮＡ分ｒ皿ＤＬ２０００；１：扩增产物
Ｆｉ９１
图２ＭＤＩｔＡＲ差固３’片段巢式ＰＣＲ扩增电诛围谌 Ｍ：ＤＮＡ分ｆ量ＤＬ２０∞；１：扩增产物
序结粜表啊该３’ＰＡＣＥ产物人小为５９７ｂｐ（Ｉ目２）。结合保守Ｋ片段设计』条下游引物，用基
闲特异引物ＰＲ２进行逆转录．ＰＲ３和ｐＲ４分别进行５’端第一轮和第二轮ＰｃＲ扩增，经测序 该５’端核序酸序列人小为Ｊ９０ｂｐ（图３）。
２０００ｂｐ
ｚｏｏｏｂｐ
∞瓣∞
２５０ｂｐ １ ＯＯｂｐ
７５０ｂｐ ５００ｂｐ ２５０ｂｐ １００ｂｐ
胶电泳，然后进行逆转录。
１．３保守片段的克隆
根据ＧｅｎＢａｎｋ核酸数据库中报道的拟南芥、大白菜、芥菜、冰叶日中花ＭＤＨＡＲ的ｍＲＮＡ 序列，通过ＤＮＡＭＡＮ设计保守Ｉｘ．兼Ｊｔ：弓ｌ物ＰＦｌ和ＰＲｌ。ＰＣＲ反应程序为：９４℃５ ｒａｉｎ，９４℃