量子点在生物标记中的应用【摘要】：生物医学检测领域，荧光标记分子是研究抗原-抗体，DNA链段、酶与底物等分子间相互作用的重要研究工具。

荧光量子点作为一种新型荧光纳米材料，具有量子效率高，摩尔消光系数大，光稳定性好，可控的荧光发射波长和宽的荧光激发波长范围等优异的光学性能，因而在生物分析，检测等领域得到广泛应用。

前言纳米量子点是准零维材料。

当颗粒尺寸和电子的德布罗意波长相比拟的时候，尺寸限域将引起尺寸效应，小尺寸效应和宏观量子隧道效应，从而展现出不同于宏观材料的光学性质。

[1]由于其独特的发光性质，量子点在医学生物芯片，药物和基因载体、以及生物化学分析、疾病的诊断与治疗等方面的应用得到的广泛的关注。

与传统荧光染料相比，量子点存在以下优点：[2]（1）量子点的发射光谱可以通过改变量子点的尺寸大小来控制。

通过改变量子点的尺寸和它的化学组成可以使其发射光谱覆盖整个可见光区。

而传统的邮寄荧光染料激发光谱窄，发射光谱很宽。

激发光谱窄导致每一个不同的荧光染料必须使用一种特定的激发波长来激发，限制了使用有机荧光染料作为荧光探针进行多色标记。

而且其荧光发射峰的半峰宽很宽，导致不同波长的有机荧光染料的发射峰彼此重叠，大大限制了可以同时使用的荧光探针的数量。

（2）量子点具有良好的光稳定性，量子点的荧光强度比最常用的邮寄荧光材料“罗丹明6G”高20倍，稳定性是100倍以上，因此，量子点可以对标记的物体进行长时间的观察。

有机荧光染料的荧光稳定性不好，见光极易分解，产生光漂白现象，导致量子产率下降，对检测过程造成影响。

（3）量子点具有宽的激发谱和窄的发射谱。

使用同一激发光源就可实现对不同粒径的量子点进行同步检测，因而可用于多色标记，极大地促进了荧光标记在生物钟的应用。

（4）量子点具有较大的斯托克斯位移。

可以避免发射光谱和激发光谱的重叠，有利于荧光光谱信号的检测。

（5）生物相容性好。

量子点经过化学修饰之后，对细胞毒性低，对生物危害小，可进行生物活体标记和检测。

（6）量子点的荧光寿命长。

有机荧光燃料的寿命一般为几纳秒，而量子点的荧光寿命可持续数十纳秒。

这使得当光激发后，大多数的自发荧光已经衰变，但量子点荧光仍然存在，此时即可得到无背景干扰的荧光信号。

量子点进行生物标记的基础1、量子点与生物分子的偶联[3]量子点和生物分子的偶联是将量子点应用到生物领域的基础，生物分子可以通过各种作用力，如静电吸附，共价偶联，配位键和生物特异性吸附等，与量子点得到生物功能化的量子点。

目前将量子点与生物分子偶联比较常见的两种方法是：（1）在碳二酰亚胺的活化作用下，将生物分子共价偶联在表面带羧基的量子点表面。

（2）含组氨酸端基的蛋白可以与含量子点表面的金属离子间产生配位作用，从而将蛋白偶联在量子点表面。

总之，制备生物分子修饰的量子点是其生物应用的基础，制备粒径均匀、胶体稳定性好，荧光量子效率高和生物活性好的荧光生物分子对于量子点的进一步应用十分关键，根据量子点的生物应用领域不同，选择合适的偶联方法。

图1 常见的两种偶联方法示意图2、量子点的亲水性改性[2]目前使用的量子点大多在有机相中合成，得到的量子点虽然具有很好的光学性质，但是这种量子点表面包覆着大量的有机分子而呈现疏水性，只能溶于有机溶剂，要应用到生物医学领域，首先必须对其表面进行亲水性改性。

此外，由于量子点表面有些原子未完全配对，含有悬空键，具有极高的表面能，很容易与其他原子结合，团聚在一起，从而形成带有若干弱连接界面的尺寸较大的团聚体。

因此通过对半导体纳米粒子表面形态的研究发现，粒子表面其实并不光滑，存在很多缺陷。

而量子点荧光的产生是由于吸收激发光后产生电荷载体重组，如果制备的量子点有大量的缺陷，就会发生电荷载体的无辐射重组，会严重影响量子产率。

因此，量子点在用于生物标记时，必须对其进行表面修饰，使其具有一定的水溶性和生物相容性。

而且亲水性改性不能改变量子点的光学性质，同时还要保证改性之后的量子点能很好地额分散在缓冲体系中，不能发生团聚，且改性后量子点粒径较小。

为了满足上述条件，发展了很多用于量子点改性的方法，主要分为两种，配体交换和高分子改性。

部分修饰方法如图1所示。

配体交换法主要是用亲水性的配体取代量子点表面的疏水配体，如选择具有双官能团（一端与量子点表面具有络合作用，另一端为亲水性基团）的配体置换量子点表面的三辛基氧化膦。

经过表面配体置换的量子点可以更方便的和蛋白、多肽及核酸等偶联。

这种方法操作简单，容易实现，但改性后的量子点不稳定，表面配体容易脱落，导致量子点易发生团聚。

对量子点的量子产率影响较大，得到的水溶性量子点光化学稳定性不好，影响量子点的存放。

为了改善配体容易脱落的缺陷，Nie等采用一种具有多个络合点的梳形结构的高分子对量子点进行改性，这种方法得到的水溶性量子点生物相容性以及胶体稳定性都非常好。

高分子改性分为两种形式，一是高分子聚合包裹，二是双亲性高分子自组装利用聚合的方法制备荧光微球。

如果将不同颜色的量子点均匀分散在同一种介质中，则聚合得到的微球可以发射多个波长。

但是这种方法容易淬灭量子点的荧光，且容易发生相分离，使得到的每个聚合物球所包裹的量子点不均匀，量子点大多处于聚合物球的外表面。

量子点大多处于聚合物球的外表面。

双亲性高分子自组装改性是将量子点包覆在双亲性聚合物中。

这些双亲性高分子含有疏水性的侧链，可以通过疏水作用与量子点表面的疏水配体结合，亲水端向外使量子点具有亲水性。

由于这种方法没有直接与纳米晶的表面反应，因而不会造成量子点的表面缺陷，对量子产率影响不大。

但是，在量子点的疏水基团外面自组装一层高分子会使量子点的水力直径改变较大。

例如，采用嵌段共聚物对量子点进行改性，改性前量子点粒径为4-8nm,改性后量子点粒径增加至30nm。

粒径的增大会产生较大的位阻效应，也会对福斯特能量共振转移产生影响。

图2 量子点几种主要表面修饰方法示意图生物标记量子点最初用于生物领域是应用于简单的生物大分子，链接方法是首先在量子点表面引入极性基团，使量子点既有水溶性又有与生物分子反应的功能性基团，再通过交联剂NHS （N-羟基琥珀酰亚胺）或EDC（乙基-3-（二甲基氨丙基）-碳二亚胺），完成量子点与生物大分子的共价偶联。

用量子点来取代传统有机荧光染料则可改善有机荧光染料存在的几个问题，如光稳定性不好，信号强度不够大，以及需要特定波长的光激发才会发出荧光。

因为量子点具有极佳的光学稳定性，并且可以用同一个激发波长激发而拥有不同发射波长的光学性质。

利用这个特性可以在具有不同荧光颜色的量子点上连接各种抗体或是不同类型的多肽，再由这些分子与细胞之间的特异性的识别，使量子点连接在细胞的特定的位置，再利用同一激发波长激发量子点就可观察到不同色量子点所在的位置。

1998年，Bruehez M J等用两种不同大小，分别发绿色和红色荧光的量子点做探针，标记3T3小鼠的成纤维细胞，通过静电引力、氢键作用或特异的配体/受体相互作用将生物分子结合在量子点的表面。

发射绿光的量子点与尿素和乙酸结合，标记细胞核，发射红光的量子点特异性地标记F-肌动蛋白丝，从而在细胞中同时观察到红色胞衆肌动蛋白和绿色的细胞核，这是量子点生物标记应用的开始。

2001年，张春阳等用量子点标记了天花粉蛋白，同时，进一步研究了天花粉蛋白在人绒癌细胞内的分布，证实了其进入细胞的机理，为研究靶向药物的作用机理提供参考和依据。

2003年，Jaiswal J K等将二氧硫辛酸包覆的CdSe/ZnS量子点与连接了抗体的蛋白质通过静电自组装链接，用不同颜色的QDs同时对多个活细胞进行一般性或特异性标记，并在细胞生长和分化过程中进行长期成像和跟踪，发现标记了的细胞很稳定，超过一周也未检测出对细胞形态和生理有任何有害影响，并管和在其体内的乳腺癌的肿瘤血管。

Yu等将量子点与能靶向于肝细胞癌的甲胎蛋白抗体共价连接，作为荧光探针，通过整体的荧光成像系统对肝癌细胞进行成像，来检测活体内的肝癌细胞。

图3 量子点标记3T3小鼠成纤维细胞[7]在量子点生物效应和应用研究中，量子点与蛋白质尤其是血清蛋白的相互作用，包括量子点与蛋白质的相互作用机理和作用过程，对于了解量子点作用下蛋白质结构与功能变化等方面的信息，认识其相互作用的本质，以及对其它各类纳米颗粒的毒性效应和应用等各个方面，都有着重要的意义。

要研究量子点与蛋白质的相互作用，必须要了解蛋白质的结构和功能。

蛋白质是生物体内一类主要的生物大分子，担负生命活动的各种生理功能，维持生物新陈代谢活动的进行，也是生物性状的直接表达者，具有广泛重要的生物学功能。

它是组成生命的物质基础，它与生命及各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质，在生命活动中具有十分重要的地位。

蛋白质的各类研究是当前生命科学、医药学及环境科学研究中所共同关注的课题。

蛋白质的结构分为四级结构，即一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。

其一级结构是蛋白质肽链中氨基酸残基的排列顺序，也是蛋白质分子的基本结构，一级结构是空间结构及其功能的基础。

蛋白质的二级结构是指多肽链中同相邻的氛基酸残基间形成的多肽主链原子的局部空间结构，包括螺旋、折叠、转角和无规卷曲。

三级结构是指在二级结构的基础上，由肽链上相距甚远的氨基酸残基所形成的整个多肽链的空间结构，其特点是多肽链中疏水的氨基酸一般集中在分子内部，有些蛋白质仅有一条三级结构的多肽链，其表面可形成活性中心，具有活性。

蛋白质的四级结构是指由两个或两条以上具有三级结构的多肽链相互聚合而成的大分子蛋白质的空间结构。

因此，量子点可以作为外源荧光探针标记目标蛋白，用于细胞和分子生物学等医学领域的研究，有着非常广阔的应用空间。

生物体内绝大部分生化反应是由酶催化的，而酶几乎都是蛋白质，此外蛋白质还是氧和激素的载体，是免疫系统的抗体，因此对其研究有重要的意义。

但是由于蛋白质分子本身可供分析的信号较弱，因此常需借助外来标记物来获得可测量的信号，再通过所获得信号的分析，来得到高灵敏度的检测结果。

如将蛋白质与有机小分了、无机离子、金属离子配合物或量子点等结合，常用的是探针试剂。

传统的生物荣光染料探针分子只能进行单色标记，且稳定性差，灵敏度也受到限制，而量子点作为蛋白质的荧光探针分子其激发光谱宽、荧光发射谱线窄、荧光量子产率高、发出的光线颜色可调、可进行多色标记，光稳定性好和特异性强等一系列优点。

同样地，是生命的遗传物质，是一种十分重要的生物大分子。

随着现代分子生物学和分子生物技术的发展，已成为人们研究的热点，分子的定量分析和特异性识别对基因组学、病理学、分子生物学等生命科学的发展具有十分重要的意义。

而荧光分析法因其简便快速、灵敏度高成为分析的重要手段之一，由于本身无明显的劳光，所以需寻求的外援探针，量子点作为一种高灵敏度的荧光探针，可用来判断其它小分子与的作用模式。