第14卷第2期2004年4月󰀁江苏大学学报(医学版)JournalofJiangsuUniversity(medicine)󰀁Vol.14No.2Apr.2004󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁小鼠GITRL基因的克隆和序列分析王胜军1,2,马󰀁斌1,仝󰀁佳1,许化溪1,杨胜利2(1.江苏大学医学技术学院免疫学研究室;2.江苏大学生命科学研究院,江苏镇江212001)[摘󰀁要]󰀁目的:克隆小鼠GITRL基因全长编码区的cDNA,同时对其序列分析。方法:采用RT󰀁PCR方法,从小鼠树突状细胞获得GITRL基因的cDNA,克隆至pMD18󰀁T载体,选择阳性克隆并进行序列测定。结果:扩增得到的GITRL基因编码区cDNA的全长519bp,编码173个氨基酸残基,与GeneBank中发表的序列完全一致。结论:获得小鼠GITRL基因的克隆,为进一步研究其生物学功能提供基础。[关键词]󰀁GITRL基因;cDNA克隆;RT󰀁PCR;调节性T细胞;小鼠[中图分类号]󰀁R394󰀁󰀁[文献标识码]󰀁A󰀁󰀁[文章编号]󰀁1671-7783(2004)02-0097-04CloningandSequenceAnalysisofMouseGlucocorticoid󰀁inducedTumorNecrosisFactorReceptorLigandGeneWANGSheng󰀁jun1,2,MABin1,TONGJia1,XUHua󰀁xi1,YANGSheng󰀁li2(1.DepartmentofImmunology,SchoolofMedicalTechnology,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212001,China;2.LifeScienceInstitute,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212013,China)[Abstract]󰀁Objective:TocloneandanalyzethecDNAencodingmouseglucocorticoid󰀁inducedtumornecrosisfactorreceptorligand(GITRL)gene,atype󰀂transmembranceproteinofthetumornecrosisfactor(TNF)su󰀁perfamily.Methods:ThecDNAofGITRLwasamplifiedfromtotalRNAextractedfrommousedendriticcells(DC)byRT󰀁PCRandinsertedintopMD18󰀁Tvector,andthesequenceoftheDNAwasanalyzed.Results:ThecDNAofGITRLhasthelengthof519bpwithancompleteopenreadingframe,whichencodesaproductof173aminoacidandshares100%homologywiththesequenceofmRNAformouseGITRLinGeneBank.Conclu󰀁sion:ThecDNAofGITRLwassuccessfullycloned,whichbroughtafoundationforfurtherresearchingonitsbio󰀁logicalfunction.[Keywords]󰀁Glucocorticoid󰀁inducedtumornecrosisfactorreceptorligand;cDNAcloning;RT󰀁PCR;Dendrit󰀁iccell;Mouse󰀁󰀁小鼠GITR(glucocorticoid󰀁inducedtumornecrosisfactorreceptor)最初是1997年Nocentini等人[1]在地塞米松诱导T细胞杂交瘤细胞中发现的膜蛋白受体,由228个氨基酸组成,富含半胱氨酸的重复结构域,但不含DD结构域(deathdomain),具有许多TNF受体超家族的特征,被命名为TNFRSF18,随后人类对应的蛋白也被发现[2]。2003年12月Tone[3]和Kime[4]等人同时发现其配体GITRL,初步研究结果表明GITRL具有阻断CD4+CD25+调节性T细胞(regulatoryTcell,Treg)免疫抑制功能的作用。本研究从小鼠树突状细胞(dendriticcells,DCs)中通过RT󰀁PCR扩增出GITRL的cDNA,并进行序列分析。1󰀁材料和方法1󰀂1󰀁材料RPMI1640及胎牛血清为Gibco公司产品,小鼠GM󰀁CSF、TNF󰀁为Peprotech公司产品,PE标记抗小鼠H󰀁2Kd单克隆抗体及FITC标记抗小鼠CD11c单克隆抗体为BDPharmingen公司产品,Trizol及逆转[基金项目]国家自然科学基金资助项目(30300169)和江苏省社会发展资助项目(BS2000026)[作者简介]王胜军(1969-),男,江苏镇江人,副教授,主要从事免疫调节研究。录试剂盒为Invitrogene公司产品,ExTaqDNA聚合酶、dNTP、EcoRI及SalI核酸内切酶、pMD18󰀁Tvector为TakaraBiotec公司产品,x󰀁gal和IPTG为Sigma公司产品,DL2000和LambdaDNA/EcoRI+HindIII分子质量标准分别为TakaraBiotec公司和MBI公司产品,PCR产物纯化试剂盒为Macherey󰀁Nagel公司产品,质粒提取试剂盒为Qiagen公司产品,大肠杆菌DH5󰀁为本室保存。1󰀂2󰀁引物设计与合成根据GenBank中小鼠GITRL基因ORF序列,通过PrimerPremier5󰀂0软件设计引物,由上海博亚生物技术有限公司合成。引物序列如下:P1:5 󰀁GTTCTCATTCCATCAGAGAACG-3 P2:5 󰀁CTAAGAGATGAATGGTAGATCAGG-3 1󰀂3󰀁DCs诱导及鉴定断颈处死小鼠,取股骨骨髓,洗涤计数,用含200U/mlGM󰀁CSF的完全RPMI1640培养基将细胞浓度调整为2!105/ml,在每只10cm的细胞培养皿中加入10ml;第3天后加入含200U/mlGM󰀁CSF的完全RPMI1640培养基10ml,第6天和第8天用含100U/mlGM󰀁CSF的完全RPMI1640培养基换半液,第10天加入终浓度为200U/mlTNF󰀁,第12天收获细胞,洗涤,荧光染色,通过流式细胞仪分析细胞纯度。1󰀂4󰀁RT󰀁PCR扩增GITRLcDNA取2!106DC,加入1mlTrizol,提取总RNA,根据逆转录试剂盒提供的方法将总RNA反转录为cD󰀁NA,以其为模板进行PCR扩增。25󰀂lPCR反应体系包括2󰀂5󰀂l10!buffer、2󰀂l2󰀂5mmol/LMgCl2、2󰀂5󰀂l2mmol/LdNTP、2󰀂lcDNA、0󰀂25󰀂lExTaq酶(5U/󰀂l)、1󰀂lP1及P2引物、13󰀂75󰀂lH2O。PCR反应条件为:94∀预变性2󰀂5min,然后94∀变性30s,60∀退火30s,72∀延伸1min,共进行35次循环,再72∀延伸5min。PCR扩增产物进行琼脂糖(10g/L)电泳,EB染色,分析鉴定。1󰀂5󰀁GITRLcDNA克隆及鉴定GITRL基因PCR扩增产物通过Macherey󰀁Nagel公司的NucleoSpin试剂盒进行回收。将回收的产物与pMD18󰀁Tvector载体连接,转化DH5󰀁宿主菌,接种含有氨苄西林、x󰀁gal和IPTG的LB平板,挑取菌落,转种LB培养基,抽提质粒,酶切,电泳鉴定。1󰀂6󰀁GITRLcDNA的序列测定与分析将经过鉴定的阳性重组质粒,使用M13F/R通用引物进行双向反应测序,将测定的核苷酸序列与GeneBank中原有序列进行比较分析。2󰀁结󰀁果2󰀂1󰀁DC细胞纯度分析小鼠骨髓细胞经GM󰀁CSF+TNF󰀁诱导培养后,通过流式细胞仪分析,细胞表面MHCII分子H󰀁2Kd为88󰀂49%,DC特征性表面分子CD11c为83󰀂82,结果见图1。

图1󰀁小鼠DC细胞流式细胞仪分析结果2󰀂2󰀁GITRL基因RT󰀁PCR扩增结果DC细胞抽提总RNA,以反转录产物为模板,采用特异的GITRL引物,通过PCR扩增得到目的基因,长度在519bp,与目的片段基本一致(图2)。2󰀂3󰀁重组质粒的筛选与鉴定将PCR产物与pMD18󰀁Tvector载体连接,连接产物转化DH5󰀁菌,随机挑取白色菌落,抽提质粒,双酶切、电泳后,阳性克隆条带分别为2692bp和519bp左右,结果见图3。2󰀂4󰀁测序结果及分析我们克隆出的目的基因,测序结果显示其编码98󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁江苏大学学报(医学版)󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁第14卷区为519bp,编码173个氨基酸残基,结果见图4。与GeneBank中原有序列(AY267900)比较,两者编码区序列完全一致。

1.DL2000标记;2.PCR扩增产物图2󰀁FoxP3基因RT󰀁PCR扩增结果

1.双酶质粒;2.单酶切质粒;3. DNA/EcoRI+Hind#标记图3󰀁FoxP3基因重组质粒的鉴定3󰀁讨󰀁论机体的外周免疫耐受可以通过抑制性细胞发挥免疫抑制作用,自从Sakaguchi[5]1995年发现CD4+CD25+Treg细胞具有抑制自身免疫性疾病的作用以来,有关Treg细胞的研究方兴未艾,目前主要集中在自身免疫性疾病和肿瘤免疫两个方面[6]。Treg细胞的免疫抑制功能是通过细胞间的直接接触方式发挥作用,Treg细胞相关的分子标志为CD4、CD25、CT󰀁LA󰀁4、GITR和FoxP3(scurfin)。Shimizu[7]和McHugh等人[8]在研究CD4+CD25+Treg细胞介导免疫抑制的分子通路时发现,GITR的拮抗性抗体可以阻断CD4+CD25+Treg细胞介导的免疫抑制功能,但对CD4+CD25-T细胞没有作用。这些实验结果提示机体可能存在GITR配体(GITRL),并可能具有相似的阻断CD4+CD25+Treg细胞免疫抑制功能的作用。这种猜测随后被Tone和Kime等人证实,同时发现这种阻断作用与CD4+CD25+T细胞的NF-!B被活化有关;而GITRL与初始T细胞及Th1、Th2细胞表面的GITR的结合可给提供协同刺激信号,促进其增殖。这些特性显示GITRL在抗瘤免疫中具有重要的应用前景,一方面可以解除由Treg细胞介导的∃肿瘤免疫耐受%,另一方面刺激机体效应性T活化、增强机体的抗瘤免疫能力。

图4󰀁GITRL基因的cDNA序列及对应的氨基酸序列󰀁󰀁小鼠GITRL基因位于其1号染色体,邻近OX40L,其开放阅读框架包含519bp,编码的蛋白由173氨基酸组成,分子量为20Kda,类似于TNF家族󰀂型跨膜蛋白,其胞质区包含21个氨基酸,跨膜区为23个氨基酸,胞外区由129个氨基酸组成。本实验通过RT󰀁PCR从小鼠DC获得GITRL基因的cD󰀁NA,通过与GeneBank中发表的GITRL基因比较,两者的序列完全一致,长度为519bp,可编码173个氨基酸残基。成功克隆到GITRL基因,为进一步研究Treg细胞的分化发育途径和相关疾病的治疗提供了实验基础。(下转第102页)99第2期󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁王胜军,等.小鼠GITRL基因的克隆和序列分析