收稿日期:2002-12-12;修回日期:2003-09-13作者简介:曹玉华(1964-),女,江苏通州人,副教授,博士.毛细管电泳电化学检测法测定胡黄连中香草酸和阿魏酸的含量曹玉华,汪云(江南大学化学与材料工程学院,江苏无锡214036)摘要:采用毛细管电泳电化学检测法测定了胡黄连中香草酸和阿魏酸的含量;研究了电极电位、运行缓冲液的浓度和酸度、电泳电压及进样时间等对电泳的影响,得到了最优化的测定条件;以直径为300μm 的碳圆盘电极为检测电极,工作电极电位为0.8V (v s .SCE ),在50mm ol/L 硼砂(p H 8.4)运行缓冲液中,上述两组分在8m in 内完全分离;香草酸和阿魏酸线性范围分别为5×10-4～1×10-6m ol/L 和1×10-3～1×10-6m ol/L ,检出限分别为4.2×10-7和3.0×10-7m ol/L ;7次平行进样的相对标准偏差(RS D )为2.2%和2.8%,回收率(n =3)分别为99%和103%,该法灵敏可靠,结果令人满意。

关键词:毛细管电泳;电化学检测;胡黄连;香草酸;阿魏酸中图分类号:O657.8;Q949.777.8文献标识码:A文章编号:1004-4957(2003)06-0095-03胡黄连为玄参科植物胡黄连的根茎[1],具有清热凉血、燥湿消疳的作用[2],用于治疗肝脏、肺部疾病,也可治疗慢性痢疾[3]。

主要含胡黄连素、胡黄连醇、D -甘露醇、香草酸、三棕榈酸甘油脂、类倍半萜挥发油及少量的阿魏酸等芳香酸。

1995年版的《中国药典》是以香草酸为胡黄连的质量检测依据。

已有薄层扫描[4]、高效液相色谱[5,6]、毛细管电泳-紫外检测[7]用于胡黄连中的酚酸、胡黄连甙的分析。

毛细管电泳(CE )具有分离效率高,消耗样品少,无需昂贵的色谱柱与复杂的前处理等诸多优点,且电化学检测(ED )对于电活性物质不仅具有较高的灵敏度,且具有选择性,对于复杂的中药测定体系,CE -ED 法极具潜力。

本文建立了用CE -ED 测定胡黄连中香草酸、阿魏酸含量的方法,为制订其质量标准提供依据。

1实验部分1.1仪器与试剂毛细管电泳-电化学检测系统(CE -ED )为自组装[8],包括±30kV 高压电源(上海原子核研究所),BAS LC-3D 安培检测器(Bioanal y tical S y stems ,USA ),XW DT -164型记录仪(上海大华仪表厂),50cm 长熔融石英毛细管(内径25μm ,外径360μm ,P ol y m icro T echnolo g ies ,USA )。

香草酸、阿魏酸(生物试剂,上海试剂二厂),胡黄连购于上海、苏州药店,其它试剂均为分析纯。

实验用水为二次蒸馏水。

1.2溶液配制香草酸和阿魏酸标准储备液:1×10-2m ol/L ,用无水乙醇配制,再用运行缓冲液稀释至所需浓度。

1.3实验方法使用自组装的CE -ED 装置,电化学检测池为三电极体系:碳圆盘电极为工作电极,饱和甘汞电极(SCE )为参比电极,铂丝为辅助电极。

通过三维定位调节器使工作电极与毛细管出口在同一直线上,并尽可能靠近毛细管末端。

采用电动进样,在14kV 下从毛细管阳极端进样6s ,检测池为阴极电泳槽。

2结果与讨论2.1电泳条件的选择2.1.1香草酸和阿魏酸的流体伏安图图1为香草酸和阿魏酸在碳圆盘电极上的H DV 图,从图中可以看出,电位大于0.40V第22卷第6期分析测试学报V ol.22N o.62003年11月FENXI CESHI XUE BAO (Journal of Instrum ental Anal y sis )N ov.2003图1香草酸和阿魏酸的流体伏安图F i g .1H y drod y nam ic v oltamm o g ram (H DV )of vanillic acid and ferulic acid at 300μm diam eter carbon disk electrode in a 50mm ol/L borax buffer (p H 8.4)c (vanillic acid )=c (ferulic acid )=2×10-4m ol/L图2缓冲溶液p H 值对迁移时间(A )和峰电流(B )的影响F i g .2E ffects of p H on m i g ration tim e (A )and on p eak current(B )of tw o anal y tes电极电位:0.8V ,其他条件同图1(w orkin g p otential :0.8V ,theother conditions are the sam e as F i g .1)96分析测试学报第22卷图3标样(A )和胡黄连样品(B )的毛细管电泳图F i g .3E lectro p hero g ram of standard solution containin g2×10-4m ol/L anal y tes (A )and t y p ical of Rhizom a P i -crorhizae (B )under the o p timum conditions1.ferulic acid ;2.vanillic acid3CE -E D conditions are the sam e as in F i g .3,33In the re g ression e q uation ,the x value is the concentration of anal y tes (m ol/L ),the y valueis the p eak current (nA )2.3样品测定及回收率实验将胡黄连在研钵中研成细粉,准确称取1.000g 于50m L 容量瓶中,加入10.00m L 无水乙醇提时,香草酸和阿魏酸开始有电化学响应,随着氧化电位的提高,两物质的峰电流迅速增加,到达0.80V 时灵敏度增加变缓,继续提高电极电位虽然可以提高峰电流,但本底电流也增加,噪音提高,故选择检测电位为0.80V (v s .SCE ),测定灵敏度高且稳定性较好。

2.1.2运行缓冲液的酸度与浓度运行液浓度直接影响物质的分离度、分析速度和灵敏度。

试验了浓度在25～100mm ol/L 范围内p H 8.4的硼砂缓冲液的影响。

发现:在25mm ol/L 的运行液中,两物质无法完全分开;而75～100mm ol/L 的运行液导致分析时间拉长,峰电流下降;故选择50mm ol/L 硼砂缓冲液作运行液。

尝试了在p H 8.0～9.2范围酸度变化对分离及分析灵敏度的影响。

结果如图2所示。

p H 8.0～8.2范围内两物质无法达到基线分离。

随着p H 值增加,两者的迁移时间差别拉大,有利于两种组分达到基线分离;但峰电流却随之下降,不利于分析灵敏度。

综合考虑,采用p H 8.4的硼砂缓冲液。

2.1.3分离电压与进样时间的选择实验表明,提高分离电压可以缩短被分析物的迁移时间、增加峰电流以提高分析灵敏度。

但当电压大于16kV 时,香草酸和阿魏酸无法分离,同时高的电压对电化学检测器的干扰也增大,基线噪音增加。

选择14kV 为分离电压。

在分离电压为14kV 时,试验了进样时间与香草酸和阿魏酸峰电流关系。

发现进样时间超过6s 后峰高增加不明显,却引起电泳峰展宽。

选择进样时间为6s (14kV ),此时峰形良好,分析灵敏度较高。

在优化条件下测得的香草酸和阿魏酸混合标准溶液的电泳图谱见图3A 。

2.2重复性、线性及检出限2.2.1重复性在上述优化条件下,将2×10-4m ol/L 香草酸和阿魏酸混合标准溶液连续进样7次,重复性良好。

峰高的相对标准偏差(RS D )为2.2%(香草酸)和2.8%(阿魏酸)。

2.2.2回归方程、线性范围及检出限配制了一系列不同浓度的两种组分的混合标准溶液,在选定的条件下,试验了各组分的线性范围,得出各组分的线性回归方程,并以噪音电流3倍值对应的浓度估算了检出限。

所得结果如表1所示。

表1回归方程、线性范围和检出限T able 1T he re g ression e q uations and detection lim its3C om p ound Re g ression e q uation33C orrelation coefficientLinear ran g eDetection lim itc /(m ol ・L -1)c /(10-7m ol ・L -1)F erulic acid (阿魏酸)y =9.56×104x +0.570.99981×10-6～1×10-33.0Vanillic acid (香草酸)y =9.69×104x -0.360.99971×10-6～5×10-44.2第6期曹玉华等:毛细管电泳电化学检测法测定胡黄连中香草酸和阿魏酸的含量97表3回收率结果(n =3)T able 3T he results of recover y (n =3)C om p ound Ori g inalAddedF oundRecover yRS D c O /(m ol ・L -1)c A /(m ol ・L -1)c F /(m ol ・L -1)R /%s r /%F erulic acid2.27×10-52.0×10-42.29×10-4102.8 1.6Vanillic acid2.02×10-42.0×10-43.98×10-499.01.7该法简单可靠,灵敏度高,可以推荐作为胡黄连质量检测的快速分析方法。

参考文献:[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典:一部[M].北京:化学工业出版社,1995.204.[2]江苏新华医学院.中药大辞典[M].上海:上海科学技术出版社,1996.1548-1550.[3]巢志茂.胡黄连活性成分的研究进展[J ].国外医学中医中药分册,1993,15(2):1-3.[4]虞金宝,宋友昕,程怡.薄层扫描法测定胡黄连中香草酸的含量[J ].中国中药杂志,1999,24(2):102-104.[5]王菁,张朝晖,戴永健,等.HP LC 测定胡黄连中胡黄连甙-Ⅱ的含量[J ].中国药科大学学报,2000,31(5):368-370.[6]张朝晖,戴永健,王瑾,等.RP -HP LC 测定胡黄连中胡黄连甙-Ⅱ的含量[J ].南京军医学院学报,2000,22(3):149-151.[7]BO T,LI K,LIU H.Anal y sis of active constituents in Rhizom a P icrorhizae b y ca p illar y zone electro p horesis[J ].Journal of Li q uid Chrom ato g ra p h y &Related T echnolo g ies ,2002,25(17):2601-2613.[8]叶建农,金薇,赵学伟.蔗糖水解反应速率常数的毛细管电泳测定方法研究[J ].高等学校化学学报,1998,19(1):31-34.Determ ination of Vanillic Acid and Ferulic Acid in Rhizom a P icrorhizae b y Ca p illar yE lectro p horesis w ith E lectrochem ical DetectionCAO Y u-hua ,W ANG Y un(S chool of Chem ical and M aterial En g ineerin g ,S outhern Y an g ze Universit y ,Wux i 214036,China )Abstract :T he determ ination of vanillic acid and ferulic acid in Rhizom a P icrorhizae b y ca p illar y electro p horesisw ith electrochem ical detection (CE -ED )w as re p orted in this p a p er.T he effects of w orkin g electrode p otential ,concentration and p H value of the runnin g buffer ,se p aration v olta g e and in j ection tim e w ere investi g ated.Vanillic acid and ferulic acid could be base -line se p arated in a 50mm ol/L borax buffer (p H 8.4)w ithin 8m in.A 300μm diam eter carbon disk electrode w as used as the w orkin g electrode p ositioned carefull y o pp osite the outlet of the ca p illar y in a w all -j et confi g uration at p otential of 0.80V (v s .SCE ).T here is an ex cellent linearit y betw een p eakcurrent and anal y tes concentration in the ran g e of 5×10-4～1×10-6m ol/L and 1×10-3～1×10-6m ol/L w iththe detection lim its (S /N =3)of 3.0×10-7and 4.2×10-7m ol/L for vanillic acid and ferulic acid ,res p ectivel y .T he relative standard deviations (RS D )of the p eak currents of vanillic acid and ferulic acid w ere 2.2%and 2.8%(n =7),res p ectivel y .Recoveries of 99%for vanillic acid and 102.8%for ferulic acid w ere obtained (n =3).K e y words :Ca p illar y electro p horesis ;E lectrochem ical detection ;Rhizom a Picrorhizae ;Vanillic acid ;Ferulic acid取,超声助溶30m in 后,上层清液经0.22μm 聚丙烯滤膜过滤。