毛细管电泳电化学检测法研究肉苁蓉多糖的单糖组成龚立冬,曹玉华3,侯建霞,汪 云(江南大学化学与材料工程学院,江苏无锡214122)[收稿日期] 2006207227[通讯作者] 3曹玉华,Tel:(0510)85800939,E 2mail:yuhuacao @yahoo 肉苁蓉为列当科肉苁蓉属多年生高等寄生植物,具有补肾壮阳、填精补髓、养血润燥、悦色延年之功效[1]。
本属植物全世界约有18个种,我国约有4种1变种,分别为肉苁蓉C istanche deserticola Y .C .Ma 、盐生肉苁蓉 C.salsa (C .A.Mey .)G .Beck,管花肉苁蓉 C.tubulosa (Schenk )R.W ight 、白花盐肉苁蓉C.salsa var .a lbiflora P .F .Tuet Z .C .Lou 及沙苁蓉 C.sinensis G .Beck,《中药大辞典》收载有3种:盐生肉苁蓉、肉苁蓉、迷肉苁蓉 C.am bigua(Bge .)B.Beck [2]。
《中国药典》仅收载了肉苁蓉C.deserticola 为药用肉苁蓉[3]。
由于肉苁蓉珍贵稀少,目前有大量人工栽培的代用品。
肉苁蓉中的主要活性成分为苯乙醇苷类化合物、肉苁蓉多糖、甜菜碱、D 2甘露醇等[4]。
对肉苁蓉多糖的研究大都集中在多糖的提取分离、总糖含量测定及其理化性质的研究方面[5,6]。
对肉苁蓉多糖的单糖组成及其摩尔比研究的报道少见[1]。
常见的多糖中单糖含量测定的方法有薄层色谱法、气相色谱法、分光光度法、高效液相色谱法、毛细管电泳2紫外检测等[7211],这些方法往往检测灵敏度不高,或需柱前衍生,操作繁琐。
毛细管电泳2电化学检测系统(CE 2ED )对糖类的测定具有快速、灵敏、选择性好的特点,由于糖类物质在结构上具有多羟基的特性,碱性条件下,易在铜电极上发生氧化还原反应,使用电化学检测器进行检测,不需衍生直接测定[12],可以得到较高的灵敏度。
且采用铜电极,安培检测糖类物质,具有高的选择性,肉苁蓉中大多数物质在铜电极上没有响应,肉苁蓉粗多糖不需严格纯化。
本研究采用CE 2E D 对不同种肉苁蓉粗多糖中单糖的组成及其各单糖相对摩尔比进行了初步的研究。
1 仪器和试剂毛细管电泳2电化学检测系统(CE 2E D )为自组装,包括±30k V 高压电源(上海原子核研究所),BASLC -3D 安培检测器(B i oanalytical Syste m s,US A ),H W -2000色谱软件(上海千谱软件有限公司)。
长熔融石英毛细管(70c m,25μm,河北永年仪器厂)。
半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、蔗糖、棉子糖均为分析纯(上海试剂一厂)。
其他试剂均为分析纯,水为重蒸水。
半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、蔗糖、棉子糖标准储备液质量浓度分别为9×10-4,912×10-4,912×10-4,715×10-4,9×10-4,1×10-3,1×10-3g ・mL-1,用蒸馏水配制,再用运行缓冲液稀释至所需浓度。
本试验所用药材为内蒙产肉苁蓉、新疆产管花肉苁蓉、人工栽培管花肉苁蓉均由洛阳高新开发区陆生天然植物研究所王忠东教授鉴定。
具体药材来源见表1。
表1 药材产地及来源品种来源产地C istanche deserticola 内蒙古无锡中药采购供应站C .tubulosa 新疆 甘肃兰州安泰堂药店C .tubulosa新疆 新疆民丰浴丰生态科技有限公司(人工栽培)2 方法2.1 肉苁蓉粗多糖的制备 将肉苁蓉原药材切成片状,置于60℃烘箱中烘60m in 。
药材粉碎,精确称取药材约20g,置150mL 锥形瓶中,加入50mL 石油醚(60～90℃)超声提取约20m in,过滤得滤渣,重复以上操作3到4次;滤渣加入80%乙醇50mL,超声提取20m in,过滤得滤渣,重复此操作3到4次;滤渣挥干溶剂后,置250mL 圆底烧瓶中,加入蒸馏水150mL,90℃水浴加热1h,超声提取30m in,过滤,重复操作4次,滤液合并约600mL 减压浓缩至约100mL,活性碳脱色,以sevag 法脱蛋白,此过程重复数次,至静置后无蛋白析出。
浓缩溶液至20mL,加入乙醇至溶液含醇量达80%以上,静置过夜析出固体物质,过滤,沉淀相继以无水乙醇、丙・3702・酮、乙醚反复洗涤干燥,即得肉苁蓉棕褐色粗多糖固体。
60℃烘干备用。
2.2 肉苁蓉粗多糖的水解方法 采用盐酸、硫酸稀酸溶液进行肉苁蓉粗多糖的水解研究,以不同比例的盐酸、硫酸混合,在100℃水浴条件下水解。
方法1 肉苁蓉多糖0106g,加入6mL2mol・L-1硫酸及2mL蒸馏水,在沸水浴下回流水解5h,取水解液2mL,用氢氧化钠中和至pH7～8,然后以011mol・L-1氢氧化钠稀释至6mL,测定前加运行缓冲液稀释。
方法2 肉苁蓉多糖0106g,加入4mL1mol・L-1硫酸及4mL1mol・L-1盐酸,沸水浴下回流水解6h,以下步骤同方法1。
方法3 肉苁蓉多糖0106g,加入3mL1mol・L-1盐酸,2mL2mol・L-1硫酸及3mL蒸馏水,沸水浴下回流水解8h,以下步骤同方法1。
方法4 肉苁蓉多糖0106g,加入2mL1mol・L-1盐酸,4mL015mol・L-1硫酸及2mL蒸馏水,沸水浴下回流水解4h,以下步骤同方法1。
方法5 肉苁蓉多糖0106g,加入6mL1mol・L-1盐酸,2mL蒸馏水,沸水浴下回流水解6h,以下步骤同方法1。
2.3 毛细管电泳测定方法 使用自组装的CE2E D 装置,电化学检测为三电极体系:01328mm直径的铜圆盘电极为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝为辅助电极。
铜电极使用前先用砂纸打磨再超声清洗2m in,通过三维定位调节器时使之与毛细管出口在一条直线上,并尽可能靠近毛细管的末端。
试验条件:分离电压16kV;进样时间6s;电极电位0165V;电泳运行液011mol・L-1氢氧化钠。
3 结果与讨论3.1 肉苁蓉多糖中单糖组分的鉴定 半乳糖(514×10-5g・mL-1)、葡萄糖(515×10-5g・mL-1)、鼠李糖(515×10-5g・mL-1)、阿拉伯糖(415×10-5g・mL-1)、果糖(514×10-5g・mL-1)以及蔗糖(516×10-5g・mL-1二糖)、棉子糖(6×10-5g・mL-1三糖)在上述电泳条件下进行CE2E D 测定,混合标样的CE图谱如图1所示。
将肉苁蓉粗多糖按2.2所述方法进行水解,相同电泳条件下测定,粗多糖水解液的CE2ED图谱见图2。
以加入单糖标准溶液记录峰高及峰面积变化的方法对水解液中的单糖组分的进行定性,确定内蒙产正品肉苁蓉 C.deserticola粗多糖水解液中的单糖为半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖;新疆产管花肉苁蓉 C.tubulosa粗多糖水解液中单糖为半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、果糖;新疆人工栽培管花肉苁蓉C.tubulosa粗多糖水解液中的单糖为半乳糖、葡萄糖、鼠李糖。
结果表明,3种样品肉苁蓉粗多糖的单糖种类有明显差异。
3.2 5种单糖定量方法研究3.2.1 精密度试验 对5种单糖混合标准溶液重复进样7次,半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖的峰高、峰面积的相对标准偏差(RS D)分别为0123,0161;0136,1166;0145,0184;1100,2143;1129,2167,结果表明,该法具有很好的重复性。
3.2.2 回归方程、线性范围、检测限 将以上5种糖的混合标准溶液进行毛细管电泳电化学测定,以电泳峰的峰面积(Y)对单糖的质量浓度(X)做工作曲线,得到5种糖的回归方程、线性范围、检测限(S/N=3)见表2。
・472・表2 5种糖的回归方程、线性范围、检测限标样回归方程r线性范围/g・mL-1检测限/g・mL-1半乳糖 Y=11368×104+51327×1010X01998415×10-6～910×10-5415×10-7葡萄糖 Y=41051×104+41061×1010X01997912×10-6～912×10-5317×10-7鼠李糖 Y=41207×104+21126×1010X01997912×10-6～912×10-5912×10-7阿拉伯糖Y=01766×104+61400×1010X01998318×10-6～715×10-5318×10-7果糖 Y=-11118×105+41501×1010X01998910×10-6～910×10-5111×10-63.3 肉苁蓉粗多糖水解液中单糖的测定3.3.1 水解方法选择 采用内蒙产肉苁蓉多糖,按2.2所述方法进行水解,按2.3所述方法进行CE2 ED测定。
5种水解方法测得的单糖的浓度见表3,由此可以得出方法3的水解较为彻底,所得水解液中的各单糖浓度均较高。
表3 水解条件的选择×10-4g・mL-1 水解方法半乳糖葡萄糖鼠李糖阿拉伯糖果糖111621419214310211419412211217321228*********4116214162133105118255142183153.3.2 样品测定 精确称取不同种肉苁蓉粗多糖样品各0106g,按2.2方法水解,取水解液2mL用氢氧化钠中和至pH7～8,然后以运行缓冲液稀释至适量浓度,按2.3所述方法进行毛细管电泳测定,平行测定3次,测定结果见表4。
内蒙产肉苁蓉粗多糖单糖相对摩尔比为葡萄糖∶半乳糖∶鼠李糖∶阿拉伯糖∶果糖(10∶0175∶2134∶1129∶1131);新疆产管花肉苁蓉为葡萄糖∶半乳糖∶鼠李糖∶果糖(10∶0181∶5119∶2114);新疆人工栽培管花肉苁蓉为葡萄糖∶半乳糖∶鼠李糖(10∶2160∶1133)。
3.3.3 回收率试验 在上述内蒙产肉苁蓉粗多糖水解样品中分别加入10μL半乳糖、葡萄糖、鼠李表4 肉苁蓉多糖水解样品测定(n=3)×10-4g・mL-1 样品半乳糖葡萄糖鼠李糖阿拉伯糖果糖内蒙C istanche deserticola211±010728±0124610±0113310±0113317±0117新疆C.tubulosa115±010318±0119816±0122-319±0121栽培C.tubulosa017±0102216±0108013±0101--糖、阿拉伯糖、果糖储备液溶液进行测定。