（六）酶的抑制实验
一、实验目的
理解两大类抑制反应的基本原理和主要特点，并掌握可逆抑制反应确定的原
理和方法。
二、实验原理
根据抑制剂与酶结合的特点可分为不可逆抑制和可逆抑制二种类型，其中可
逆抑制有可分为三种类型：竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。
（1）竞争性抑制类型：
酶不能同时与底物和抑制剂结合。动力学特征为：表观米氏常数Km'增加，
Vmax'不变。（Ki为抑制剂常数，[I]为抑制剂浓度）。

][)][1(][SKIKSVvimm

)][1('immKIKK

（2）非竞争性抑制类型：
抑制剂、底物能同时与酶结合，但此复合物不能进一步分解为产物，Km ’不
变，Vmax’下降。

])[)(][1(][SKKISVvmim imKIVV][1'


（3）反竞争性抑制类型：
抑制剂必须在酶和底物结合后方能与酶形成复合物，但此物不能分解为产物。
Km'、Vmax' 都发生变化。

])[][1(][SKIKSVvimm

i
m

K
IVV][

1'


)][1('immKIKK

对于有抑制剂存在的酶促反应，也可采用1/v～1/[S]作图法，求出Km'、Ki、
Vmax'，并利用各种可逆抑制类型的动力学特点判断抑制类型。

三、实验材料
1、试剂：
（1）0.05mol/L柠檬酸缓冲液；
（2）酸性磷酸酯酶原酶液：原酶液用0.05mol/l柠檬酸缓冲液稀释25倍左右，
使测定的第五管A405，在0.6-0.7之间；
（3）1.2 mmol/L NPP；
（4）0.3 mol/L NaOH；
（5）10mmol/LKH2PO4
（6）3mmol/LNaF
2、仪器与玻璃器皿：
（1）恒温水浴槽；
（2）可见光分光光度计；
（3）试管、刻度吸管。
四、方法步骤
按表中由上至下操作：
取20支试管按下表编号，1-5号为各不相同底物浓度的样品空白管。各空白
管在加入NPP和缓冲液后，先加NaOH，后加酶液。其余各按下表操作。以1-5
管中相应的底物浓度做空白，在可见光分光光度计上测A405。
表二
管
号
试剂
（mL）

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

KH2PO4 NaF
1.2 mmol/L NPP 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

10mmol/L KH2PO4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 - - - - -
3m mol/L NaF - - - - - 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
0.05mol/L柠檬酸缓冲液 1.5 1.3 1.1 0.9 0.7 1.5 1.3 1.1 0.9 0.7
稀释酶液
35℃保温2min
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
35℃精确反应15min

0.3 mol/L NaOH 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
A405
总结：KH2PO4为竞争性抑制剂Km’增大Vmax’不变，则 Km’
=1.0,Km=0.286 Vmax’=Vmax=4*10-4,Ki=0.4。
NaF为反竞争性抑制剂， Km’增大， Vmax’增大，则 Km’=0.714，
Km=0.286 Vmax’=10-3 ,Vmax=4*10-4, Ki=-0.5.说明 NaF对反应有
促进作用，或者由于绘制曲线造成的误差，使抑制剂的效果不明显甚
至变成激活剂。但从酶活力测定A405来看，NaF反应测得的 A405的
确比无 NaF时的 A405值大，可能绘制回归曲线时，应该画非竞争性
抑制类型。但是
NaF的1/V值都在无抑制剂的下方，说明不可能为非竞争性抑制类型。
总之， NaF的类型存在争议，应多次测定并且用SPSS软件精确分析
其回归方程后，才能确定其类型。

图9 酶的抑制
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5

051015
1/[s]

1
/
v
*
1
0
4
系列1
系列2
系列3