试验流程 :鱼皮解冻剪碎 →加 6% Nacl (样 品 :溶液 = 1: 10 )浸泡 12 h →重复前一步骤 →离 心 →水洗 →粗提产品 2. 3 采用正交试验确定提取胶原蛋白的最佳条 件 [ 2、5 ]
表 5 提取胶原蛋白的正交试验结果及因素 、级差分析
酸种类 时间 溶胀比 酸浓度 吸光度 Hyp%
工产生的废弃物 ,除小部分被用于生产饲料外 ,大 部分被丢弃 ,造成了污染和浪费 。因此 ,如果能从 这些废弃物中提取胶原蛋白加以利用 ,则既可促 进淡水鱼加工废弃物的综合利用 ,同时又能为胶 原蛋白的生产和加工利用提供丰富的原料 ,可带 来不菲的经济效益 。本试验着重研究了从罗非鱼 鱼皮中提取胶原蛋白的条件 。
1材料与方法
1. 1试验材料 尼奥杂交罗非鱼鱼皮 (上海水产品加工技术
开发中心提供 ,产地广州 ) , - 20℃低温冻藏 ,试 验时于 4℃解冻 。 1. 2主要仪器
752紫外可见分光光度计 。 1. 3试验方法与步骤 1. 3. 1罗非鱼鱼皮基本组分的测定 罗非鱼鱼 皮经解冻 、滤干 、剪碎 、捣碎后 ,进行水分 (直接干 燥法 ) 、灰分 (总灰分 ) 、粗蛋白 (凯氏定氮法 ) 、脂 质 (索氏抽提法 )的测定 。 1. 3. 2测定去除非胶原蛋白的量 [ 1 ] 在浓度分 别为 1、2 、3 mg /mL 的卵清蛋白溶液中加入双缩 脲试剂 2. 0 mL ,充分混匀 ,即有紫红色出现 ,测定 540 nm 处的吸光度 ,绘制出标准曲线 ,用以测定 试验中被去除的非胶原蛋白的量 。 1. 3. 3确定罗非鱼鱼皮中胶原蛋白的含量 [ 2、3 ] 羟脯氨酸是胶原蛋白的一种特性蛋白质 ,通过 ISO3496 ( E)对羟脯氨酸的测定来确定罗非鱼鱼 皮中胶原蛋白的含量 [ 2 ] 。称取 50 m g羟脯氨酸溶 解 于 水中 , 加 1滴 硫酸 溶液 , 定容 至 1 0 0mL。移
8 3. 117 1. 055 0. 911 0. 968 0. 883 0. 085
9 3. 500 0. 736 0. 921 0. 942 0. 898 0. 044
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10的样水比条件下 ,非胶原蛋白溶出最多 。但如 果在粗蛋白含量增加时 ,羟脯氨酸的含量也相应 地增加 ,则表明其中溶出的胶原蛋白的含量也增 加 ,这显然与我们所要求的粗蛋白含量较多 ,而羟 脯氨酸含量较少相违背 。因此 ,在考虑非胶原蛋 白含量较高的同时 ,不能忽略羟脯氨酸的含量。 从表 4中直观看 ,其最佳方案为 A3B3C3,从极差 分析结果看 , A 因素的极差为 0. 244; B 因素的极 差为 0. 085; C 因素的极差为 0. 044,即对羟脯氨 酸含量的影响因素按重要性排序依次为 A > B > C。综 合 考 虑 两 个 方 面 , 选 取 的 最 佳 方 案 为 A3B2C2。因 为 对 羟 脯 氨 酸 而 言 , A3 是 关 键 , B2C2与 B3C3相差不大 ,即在 6% NaCl、12 h3 2、 1: 10的样水比条件下非胶原蛋白的含量比较多 而羟脯氨酸的含量比较少 ,为去除非胶原蛋白的 最佳条件 。
0. 5388; D 为 0. 2291,即对羟脯氨酸含量的影响 因素 ,按其重要性排序分别为 : A、C、B、D。考虑 到时间对结果的影响不是太大 ,而且 24 h的试验 显然不是很经济 ,综合两个方面 ,选取的最佳方案 为 : A1B2C1D3,即醋酸的浓度为 0. 5 mol/L、溶胀 比为 1: 20、处理 4 h。
7
A3
B1
C3
D2 0. 2065 2. 7582
8
A3
B2
C1
D3 0. 1978 3. 9000
9
A3
B3
C2
D1 0. 4872 3. 9309
K1 12. 2691 10. 1909 11. 8745 11. 2091 K2 10. 7727 11. 3127 11. 4982 10. 8673
1
A1
B1
C1
D1 0. 2004 3. 9709
2
A1
B2
C2
D2 0. 5064 4. 1055
3
A1
B3
C3
D3 0. 2854 4. 1927
4
A2
B1
C2
D3 0. 4356 3. 4618
5
A2
B2
C3
D1 0. 2367 3. 3073
6
A2
B3
C1
D2 0. 2016 4. 0036
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取 5 mL 溶液到 500 mL 的容量瓶中定容 。稀释该 溶液 10、20、30、40 mL 至 100 mL ,获得浓度分别 为 0. 5、1. 0、1. 5、2. 0 μg /mL 的羟脯氨酸标准溶 液 。四种不同浓度的羟脯氨酸标准样品经氧化脱 羧反应生成吡咯 。以对二甲氨基苯甲醛显色 ,测 定 558 nm 处的吸光度 ,绘制出标准曲线 。 1. 3. 4采用正交法确定去除非胶原蛋白的最佳条 件 [ 4 ] 用正交法确定去除非胶原蛋白的最佳 条件 (正交因素见表 1) 。鱼皮经解冻后分别加入 特定浓度 、特定样水比例的 NaCl溶液 ,于 5℃下 , 根据正交方案所确定的时间进行处理 。用尼龙纱 布过滤得滤液 ,测定滤液中蛋白质的含量 [ 5 ]和羟 脯氨酸的含量 。去除非胶原蛋白的条件的选择依 据是 :滤液中蛋白质的含量越高 ,羟脯氨酸的含量 越低 ,则非胶原蛋白的去除率越高 。
罗非鱼又称非洲鲫鱼 ,属鲈形目 、丽鱼科 。该 属共有 100多个品种 ,已被养殖的约有 15 种 ,我 国先后引进的有莫桑比克罗非鱼 、尼罗罗非鱼 、奥 利亚罗非鱼 、红罗非鱼等近 10种 。罗非鱼日益受 到大众的欢迎 ,它的消费量增加迅速 。在美国 ,罗 非鱼也日益受到大众的欢迎 ,其消费量迅速增加 。 2003年 1～4月 ,美国进口罗非鱼的数量与 2002 年同期相 比 , 从 2 万 t 增 加 到 2. 6万 t, 增 加 了 30% ;与 2003 年同期相比 , 2004 年 1 ～3 月进口 冷冻罗非鱼片增加近 100%。但是目前罗非鱼加
收稿日期 : 2006 - 06 - 01; 修改日期 : 2006 - 07 - 21 项目资助 :上海市重点学科建设项目 编号 : T1102 作者简介 :丁卓平 (1957 - ) ,女 ,副教授 ,从事食品科学与工程 、仪器分析的教学与科研 。
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罗非鱼鱼皮胶原蛋白提取条件的研究
丁卓平 刘振华 李仁冬 朱卫钦 (上海水产大学食品学院 ,上海市 200090)
胶原蛋白用途广泛 ,其制品已应用于医药 、保 健品 、食品 、化妆品等众多领域 。如胶原护肤霜 、 胶原面膜 、胶原美容口服片等系列产品 ,其内服外 用效果良好 ,满足了当前消费者对功能性产品的 强烈需求 ;目前在欧美国家 ,服用胶原产品进行皮 肤深层养护已成时尚 。据专家预测 ,我国的胶原 热潮也即将到来 。胶原也是人类皮肤的主要组成 成分 。人处于幼年时 ,皮肤中胶原的含量高 ,随着 年龄的增长 ,其含量开始逐渐下降 ,导致皮肤渐渐 丧失保湿功能 ,人体只有不断合成新胶原才能保 持皮肤健康且具有弹性 。胶原蛋白的阴离子侧链 丰富 ,能吸附大量水分 ,维持皮肤的湿润 、弹性 。 胶原蛋白含有一种独特的氨基酸 ———羟脯氨酸 (Hyp ) ,合成新胶原蛋白时需要大量的羟脯氨酸 。 除化妆品外 ,在医疗用品方面还研制了胶原止血 纱布及胶原创可贴 ,应用于外科手术 、战地救护 , 其市场巨大 ,前景广阔 。以往 ,很大一部分胶原蛋 白是从陆生哺乳动物中提取的 ,近年来 ,由于疯牛 病和口蹄疫的影响 ,人们已经开始从鱼类中提取 胶原蛋白 ,所提取的胶原蛋白更为安全 。
正交试验 非胶原蛋白 mg /mL
Hyp / % 非胶原蛋白 k1 非胶原蛋白 k2 非胶原蛋白 k3 非胶原蛋白 R
表 4 去除非胶原蛋白的正交试验结果及因素 、级差分析
1 2. 721 0. 986 3. 262 2. 870 2. 874 0. 392
2 4. 227 1. 021 2. 491 3. 290 3. 225 0. 779
3 2. 838 1. 191 3. 059 3. 491 2. 457 1. 034
4 2. 747 1. 070
5 2. 525 0. 827 Hyp k1 Hyp k2 Hyp k3 HypR
6 3. 338 0. 721
7 2. 006 0. 676 1. 066 0. 873 0. 822 0. 244
去除非胶 原 蛋 白 是 提 取 胶 原 蛋 白 的 关 键 步 骤 ,胶原蛋白的常规提取方法是去除水溶性蛋白 和盐溶性蛋白或者用稀碱去除碱溶性蛋白 。考虑 到碱会使胶原蛋白变性 [ 6 ] ,采用水和 NaCl溶液来 去除非胶原蛋白 。为有效去除非胶原蛋白 ,本试 验用正交法研究了 NaC l的浓度 ( 2%、4%、6% ) 、 处理时间 (24 h、12 h3 2、8 h 3 3 ) 、样水比例 ( 1: 5、1: 10、1: 20)三因素三水平对非胶原蛋白去除的 影响 ,测定滤液中蛋白质的含量和羟脯氨酸的含 量 [ 7 ] 。L9 (33)正交结果见表 4。9 个试验的第 2 个结果 (A1B2C2 )中 ,上清液非胶原蛋白的含量 最高 ,与正交分析得到的最佳条件即 A1B2C2 正 好 相 符 。从 极 差 分 析 来 看 , C 为 1. 034; B 为 0. 799; A 为 0. 392,所以 ,其重要性依次为 C >B > A ,即罗非鱼鱼皮样品在 2%的 NaC l、12 h3 2、1:
罗非鱼皮 鱿鱼皮 草鱼皮 鲢鱼皮
粗蛋白 26. 27 11. 13 29. 80 25. 90