水浴 37℃ 5 分钟 乙酰胆碱 0.5ml 37℃30 分钟 羟胺 2 ml 羟胺 2ml 振摇 3 分钟 乙酰胆碱 0.5 ml 37℃30 分钟
碱性羟胺 1：2 HCl 100g/L FeCl3
2 ml
振摇 3 分钟 1 ml 1 ml 振摇 1 分钟
振摇 3 分钟
摇匀 活性的分光光度 测定方法
----羟胺三氯化铁法 WS/T66-1996
一、原理
• 血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。 • 未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱与碱性 羟胺反应，生成乙酰羟胺，然后，与三氯化 铁在酸性溶液中反应，形成红色羟肟酸铁络 合物。颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。 在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆碱 的量计算胆碱酯酶活性。
2、标准曲线法
• 被水解乙酰胆碱的吸光度＝C-(A-B)。
• 被水解乙酰胆碱的吸光度查乙酰胆碱标准 曲线，得相应的被水解乙酰胆碱(μmol)。此 值是0.02mL血液在37℃30min反应条件下， 胆碱酯酶的活性绝对值。
• 正常健康人全血胆碱酯酶活性可低至正常 的80% • 轻度有机磷农药中毒为正常的50% ~70% • 中度中毒为30%~50% • 重度中毒多在30%以下 • 慢性有机磷农药中毒全血胆碱酯酶活性在 50%以下 • 酶活性下降与症状轻重并不一致，有时酶 活性严重抑制但症状却很轻微。
二、仪器
• • • • • • 分光光度计； 10mL比色管； 漏斗； 恒温水浴箱，控温±0.5℃； 采血针头； 血色素吸管。
三、试剂
• 本标准所用试剂均为分析纯试剂 1、实验用水，蒸馏水或具同等纯度的去离子水 2、盐酸溶液(1＋2) 3、碱性羟胺溶液，临用前将139g/L盐酸羟胺溶液和140g/L氢 氧化钠溶液等体积混合 4、磷酸盐缓冲液(PH＝7.20)，准确称取磷酸氢二钠 (Na2HPO4· 12H2O)8.36g和磷酸二氢钾(KH2PO4)1.36g， 用水溶解并稀释到500mL，保存在冰箱内 5、三氯化铁溶液，称取10g三氯化铁(FeCl3· 6H2O)，加 0.84mL盐酸(4.2)，然后加水100mL。贮存于棕色瓶中 6、氯化乙酰胆碱标准液：贮备液70μmol/mL乙酰胆碱；临用 前，取此溶液用磷酸盐缓冲液稀释10倍为应用液， 7μmol/mL乙酰胆碱
• 按式(2)计算酶活性的相对值：Y= Xs/ Xc
• 式中：Y—酶活性的相对值，%；
• Xs—被测血样中酶活性的绝对值， μmol(0.02mL·37℃· 30min)；
• Xc—正常人血中酶活性绝对值， μmol(0.02mL·37℃· 30min)。 Xc=1.60μmol(0.02mL·37℃· 30min)
六、计算
1、按式(1)计算酶活性的绝对值：被水解乙酰胆碱 吸光度=B-A。 • 以被水解乙酰胆碱吸光度查标准曲线得被水解乙 酰胆碱的量，此值为0.02ml血37℃30分钟反应条 件下胆碱酯酶活性绝对值= Xs/0.02 • 式中：Xs——水解乙酰胆碱的浓度， μmol(0.02mL·37℃· 30min)； • A—以试剂空白为参比的在波长520nm处样品管 的吸光度值； • B—以试剂空白为参比的在波长520nm处对照管 的吸光度值。
四、采样、运输和保存
• 用血色素吸管，取耳垂血20μL，注入比色 管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立 即进行测定。 • 如不能立即测定，可静脉取血0.5mL，注入 玻璃管中(含肝素或草酸钾抗凝剂)，混匀。 于保温瓶中加冰运送，置于4℃冰箱中可保 存一周。
五、分析步骤
管号 乙酰胆碱标准 应用液(ml) 磷酸盐缓冲液 乙酰胆碱含量 (umol) 0 0 1.0 0 1 0.1 0.9 0.35 2 0.2 0.8 0.7 3 0.3 0.7 1.05 4 0.4 0.6 1.4 5 0.5 0.5 1.75 样品 A 血 0.02 ml 0.98ml 对照 B 血 0.02 ml 0.98ml
注意事项
• 本法检测限为2.4μmol/L，线性范围为2.4～ 1000.0μmol/L。 • 使用的玻璃器皿洗净后，在1＋3硝酸中浸泡 24h，用水冲洗干净后，再用蒸馏水洗三次， 干燥后备用。 • 取血时不应过度挤压耳垂，如果采血时过度挤 压耳垂，采得的血液中血清和组织液所占比例 过多，会使结果偏低。 • 加碱性羟胺和盐酸(1＋2)时，必须严格掌握振 摇时间，使其充分反应，否则会影响结果。
• 加三氯化铁显色后，棕红色铁络合物易褪 色，必须控制在20min内比色完毕。若大批 样品分析时，可分批加入三氯化铁溶液， 否则会有较大误差。 • 滤液一定要澄清，如果出现混浊，会使吸 光度升高，而胆碱酯酶活性偏低。 • 氯化乙酰胆碱基质不太稳定，每次测定需 做标准管。标准管读数在同一比色计上应 保持恒定或仅有较小的变动。 • 计算胆碱酯酶活性百分数时，应以本地区 正常人全血胆碱酯酶活性为基准。