一株高效好氧反硝化菌的分离及特性研究杨俊忠，倪砚，许尚营，徐可瀚，刘义，曾丽霞，刘德立∗华中师范大学生命科学学院，湖北省遗传调控与整合生物学重点实验室，武汉 （430079）E-mail: deliliu2002@摘要：利用富集培养的方法从南昌市郊某养鱼塘采样分离出22株反硝化细菌，其中8株反硝化率较高，从中选择一株效果最好的作为研究对象，命名为HS-N62。

该菌在12h将培养基SC 中起始浓度为140mg/L的硝酸盐氮（NO3-N，10mmol/L）完全降解，并且没有NO2-的积累。

对其生长特性进行了研究，最适生长温度的范围是30℃-37℃，最适生长的pH 值范围是6. 0～8. 0，最适C/N比为10：1，并能利用多种碳源生长。

运用正交试验探讨了该菌株最适的反硝化条件。

通过菌株形态观察、生理生化及16S rDNA 分子鉴定，菌株HS-N62与Pseudomonas sp.亲缘关系最为接近，同源性达99 %，初步鉴定该菌为Pseudomonas sp.。

关键词：好氧反硝化；分离鉴定；特性研究1. 引言近几十年来，我国水产养殖业迅猛发展，但在水产养殖过程中的氨、硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐等营养元素含量过高所造成的富营养化现象日益严重，结果造成大量鱼虾死亡，最终导致重大经济损失，因此，控制水体中的硝态氮和亚硝态氮成为规模化养殖成功的关键之一[1]。

反硝化是将硝酸盐或亚硝酸盐还原成NO或N2的过程。

传统观点认为：反硝化细菌大2都是兼性厌氧，细菌的反硝化作用是在无氧条件下发生。

但近几年国内外的不少研究报道证明好氧反硝化菌的存在。

细菌好氧反硝化的发现,突破了传统理论的认识，为生物脱氮技术提供了一种崭新的思路[2]。

具有反硝化能力的细菌就目前所知分布于50 多个属，许多菌属如假单胞菌属( Pseudomonas )、产碱菌属( Alcaligenes)和副球菌属( Paracoccus ) 都存在好氧反硝化现象[3]。

本文从常年养鱼的池塘中采样筛选出多株好氧反硝化细菌，并研究了其生长条件及其反硝化效率，可为好氧反硝化脱氮的实际应用提供依据。

2. 材料与方法2.1 培养基富集培养基（SM，g/L）：NaNO3 0.85，丁二酸钠2.84，KH2PO4 1.36，MgSO4·7H2O 0.19，2 ml 微量元素溶液，pH 7.0～7.4。

反硝化培养基(SC，g/L)：NaNO3 0.85，丁二酸钠 4.72，酸水解酪素5.0，Na2HPO4 7.9，KH2PO4 1.5，MgSO4·7H2O 0.10，2 ml 微量元素溶液，pH 7.0～7.4。

微量元素(g/L)：CuSO4·5H2O 4.0，FeSO4·7H2O 0.70，FeCl3·6H2O 7.0，CoCl3·6H2O 0.20，NaMO4·2H2O 3.4 0，CaCl2·2H2O 2.0，pH 7.0 [3-4]。

BTB培养基(g/L)：丁二酸钠4.72，NaNO3 0.85，KH2PO4 1.0，FeSO4·7H2O 0.2，MgSO4·7H2O 0.1，琼脂15，pH 7.0。

基金项目：教育部博士点基金项目(20060511002)和“211”重点学科建设项目；湖北省科技攻关计划项目(2007AA201C50，2007AA301C26)。

2.2 富集培养和菌种分离从常年养鱼的池塘采样，将1g样品加入装有100mL SM培养基的500mL锥形瓶中，30℃静置培养3-4d，待培养基浑浊。

取10mL菌悬液于100 mL新鲜SM的锥形瓶中培养，重复操作5-6次。

将最后得到的菌悬液稀释涂布于BTB培养基。

置30℃下培养到长出明显菌落，用接种环挑取不同形态单菌落于新鲜的SM中振摇过夜(30℃)。

重复操作2-3次，直至平板菌落形态单一，无其它形态的菌落为止[3]。

2.3 菌体形态观察和生理生化鉴定取适当稀释的反硝化细菌纯培养液涂平板，置30℃培养。

待长出菌落后，观察菌落的大小、颜色等特征。

采用革兰氏染色，观察其个体形态。

细菌生理生化鉴定根据《常见细菌系统鉴定手册》进行鉴定[5-6]。

2.4 16S rDNA 序列分析细菌基因组DNA 的提取方法见文献[7]。

16S rDNA PCR 反应引物为通用引物，即正向引物为BSF8 (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，引物为BSR1492 (5’-GGTTA CCTTGTTACGACTT-3’) (上海基康公司合成)。

PCR 反应体系(25µL)：2.5µL 10×PCR缓冲液，3.5 µL MgCl2（3 mmol/L），0.5 µL 模板DNA ，0.5 µL Pf和Pr，1µL dNTP，0.5µL Taq Polymerase，16µL 超纯水。

PCR 扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30 次；72℃终延伸10 min[3,8]。

PCR产物采用纯化试剂盒纯化，测序由北京三博远志公司完成。

测序结果提交GenBank进行blast比对。

2.5 反硝化能力的测定挑取单菌落于SC 培养基中过夜培养，按1%的接种量（前培养物OD600为1）接种到装有100mL SC培养基的500mL锥形瓶中，30 ℃，120 r/min培养12h，每隔一定时间取样，测定培养基中剩余的c (NO3- ) 、c (NO2-)和c（NH4+），计算其去除率。

硝酸盐氮测定采用磺酸Brucine 法；亚硝酸盐氮测定采用N - (1-萘基) -乙二胺光度法；氨氮的测定采用纳氏试剂分光光度法。

2.6 正交法测定不同条件下的硝酸盐去除能力采用L9 (34 )正交表，按4因素3水平进行正交试验设计，考虑温度、pH、C/N和不同碳源，分别测定12 h和24 h时SC培养基中剩余的c (NO3- )，计算其去除率[9-12]。

2.7 菌株NO3-和NO2-耐受度检测配制不同浓度的以NaNO3为唯一氮源的培养基，使NO3-的最终浓度为20、50、100、150和200 mmol/L。

再以NaNO2代替NaNO3为唯一氮源，使NO2-的最终浓度为5、10、20、50和100 mmol/L。

在最优的条件和下培养，分别测定24 h和48 h时SC培养基中剩余的c (NO3- )，计算其去除率[9]。

3. 结果与分析3.1 菌株形态观察和生理生化鉴定从常年养鱼的池塘采样分离筛选出22株反硝化细菌，其中8株反硝化率较高，从中选择效果最好的一株作为研究对象，命名为HS-N62。

该菌菌落较小，圆形、整齐、隆起，乳白色，色泽一致，且质地均匀。

革兰氏染色呈阳性（G +）。

观察该菌呈杆状或棍棒状，1～2 µm 。

生理生化鉴定见表1。

表1 菌株HS-N62主要的生理生化特征Table 1 Main physiological characteristics of strain HS-N62鉴定指标 鉴定结果 鉴定指标 鉴定结果葡萄糖 +木糖 -麦芽糖 -甘露醇 -精氨酸双水解酶 +明胶液化 + DNA 酶 - 反硝化 + 七叶灵 - 氧化酶 + 硫化氢 - 接触酶 +(“+”为阳性，“-”为阴性)3.2 16S rDNA 序列测定HS-N62的16S rDNA 全序列长1492 bp ，将测得的16S rDNA 基因序列在GenBank 数据库中通过Blast 方法比对，用NJ 法构建进化树（图1）。

结果表明该菌株与Pseudomonas sp.同源性达99%。

结合菌株的形态学和生理生化鉴定可初步确定HS-N62菌株为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。

图1 菌株HS-N62同相近序列采用NJ 法构建的系统进化树Fig.1: Phylogenic tree of strain HS-N62 and similar sequences in Gene Bank, constructed by Neighbor JoiningMethod3.3 菌株反硝化能力的测定菌株HS-N62在12 h 硝酸盐氮由140 mg/L 降至5.46 mg/L ，降解率达96%。

该菌在反硝化过程中有亚硝酸盐的产生，亚硝酸盐氮的产生量在9h 达到最高，为89.4 mg/L ，但随着菌量的增长，亚硝酸盐氮的积累量减少，12h 减少为5.4 mg/L ，24h 时减少至0，这是由于硝酸盐氮可先被还原为亚硝酸盐氮，亚硝酸盐氮再逐步被还原为氮气。

SC 培养基中氨态氮的初始浓度为20 mg/L ，在培养过程中也有少量的氨态氮产生，在9h 达到最高，为57.13 mg/L，之后就呈下降的趋势。

SC培养基的初始pH为7.4，培养12h后上升到8.2，原因可能是碳源丁二酸钠的代谢产物呈碱性（图2）。

图2 菌株HS-N62的反硝化能力测定Fig.2：Denitrifying capability of strain HS-N623.4 HS-N62反硝化最适条件的确定运用正交试验法，设计不同组合（表2），对菌株HS-N62在不同条件下反硝化能力进行了测定并作方差分析。

由表2按照极差决定因素影响菌株HS-N62反硝化能力的主次顺序为：A（温度）﹥B（pH）﹥D（C源）﹥C（C/N）。

菌株HS-N62的最佳组合为A3B2C2D2，即利用丁二酸钠为碳源，C/N为10：1，pH 7，35℃。

多因素试验与各单因素试验结果基本一致。

表2 菌株HS-N62的正交试验结果The results of orthogonal experiment of strain HS-N62菌株HS-N62在20 ℃～37 ℃均能生长，在30 ℃～37 ℃时生长状态和硝态氮去除率较好，并且没有亚硝酸氮的积累。

HS-N62 生长pH 范围较宽，在pH 5～pH 10时都能生长，在pH 6～pH 9生长状态和反硝化率较好。

菌株HS-N62在不同的碳氮比的情况下都有较高的反硝化率，碳氮比为5～15时，硝态氮的去除率在24h 都能完全降解。

甚至在碳氮比为30：1的情况下也有较高的反硝化率，说明该菌在高的碳氮比废水的处理中有较好的应用前景。

碳源对菌株HS-N62反硝化能力的影响如图3。

不同碳源利用实验表明：HS-N62能利用不同的碳氮源，但不同碳源种类对菌株反硝化能力有明显影响，在葡萄糖、乳糖、蔗糖、甲醇和甘油为碳源的培养基中生长良好，有较高的反硝化率。

图3 不同碳源对菌株HS-N62反硝化作用的影响Fig.3: Denitrification activity of stain HS-N62 under different carbon source3.5 菌株HS-N62的NO 3-和NO 2-耐受度检测菌株HS-N62在NO 3- 浓度为20 mmol/L 时硝态氮去除率仍然能达到100%，在100 mmol/L （1400 mg/L ）时去除率大于60%。