精品文档 精品文档 2、 蛋白质分离的双向电泳过程 2．1溶液配制 常用水化上样缓冲液 （Ⅰ） 尿素 8M 4.805g CHAPS 4% 0.4g DTT 65Mm 0.098g Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40％） 溴酚蓝 0.001％ 10μl（1％溴酚蓝） MilliQ水 定容至100ml （Ⅱ） 尿素 7M 4.2g 硫脲 2M 1.52g CHAPS 4% 0.4g DTT 65Mm 0.098g Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40％） 溴酚蓝 0.001％ 10μl（1％溴酚蓝） MilliQ水 定容至100ml (Ⅲ) 尿素 5M 3.0g 硫脲 2M 1.52g SB3-10 2% 0.2g CHAPS 4% 0.4g DTT 65Mm 0.098g Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40％） 溴酚蓝 0.001％ 10μl（1％溴酚蓝） MilliQ水 定容至100ml 分成10小管，每小管1ml,-80℃冰箱保存。

胶条平衡缓冲液母液 尿素 6M 36g SDS 2% 2g Tris-HCl 0.05M pH8.8 3.3ml(1.5M pH8.8 Tris-HCl) 甘油 20％ 20ml 精品文档 精品文档 MilliQ水 定容至100ml 分装成10管，-20℃冰箱保存。

胶条平衡缓冲液Ⅰ 胶条平衡缓冲液母液 10ml DTT 0.2g 充分混匀，用时现配。

胶条平衡缓冲液Ⅱ 胶条平衡缓冲液母液 10ml 碘乙酰胺 0.25g 充分混匀，用时现配。

低熔点琼脂糖封胶液 低熔点琼脂糖 0.5％ 0.5g Tris 25mM 0.303g 甘氨酸 192mM 1.44g SDS 0.1% 1ml(10%SDS) 溴酚蓝 0.001％ 100μl(1% 溴酚蓝) MilliQ水 定容至100ml 加热溶解至澄清，室温保存。

30％聚丙烯酰胺贮液 丙烯酰胺 150g 甲叉双丙稀酰胺 4g MilliQ水 500ml 滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。

1.5mol/L Tris碱pH8.8 Tris碱 90.75g MilliQ水 400ml 用1mol/L HCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml, 4℃冰箱保存。

10% SDS SDS 10g 精品文档 精品文档 MilliQ水 100ml

10%过硫酸铵 过硫酸铵 0.1g MilliQ水 1ml 现用现配。 10×电泳缓冲液 （1×＝25mM Tris,192mM glycine,0.1% SDS,pH8.3） Tris碱 30g 甘氨酸 144g SDS 10g MilliQ水 1L 混匀后，室温保存。

2．2操作步骤 2.2.1 第一向等电聚焦 1.从冰箱中取水化上样缓冲液，室温溶解；在enpendoff管中，2.0mg蛋白干粉加入200μl水化上样缓冲液，室温下裂解3-4h；10000rpm常温离心10min,取上清液上样水化。具体的上样体积及蛋白质上样量如下表，

ReadyStripTMIPG胶条长度 上样体积 分析型的上样量 （银染） 制备型的上样量 （考马斯亮兰染色） 7cm 125-250μl 10-100ug 200-500ug 17cm 300-600μl 100-300ug 1-3mg

2.从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条，于室温放置10min。 3.沿着聚焦盘的边缘由左至右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品一定要连贯，同时注意不要产生气泡。 4.用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层，分清胶条的正负极，轻轻地将IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液上，使得胶条得正极对应于聚焦盘得正极。确保胶条与电极紧密接触，同时不要使胶条下面的溶液产生气泡。 5.在每根胶条上覆盖矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。 6.对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。 7cm胶条 水化 12h（17-20℃） 主动水化 S1 250V 慢速 2 h 除盐 精品文档 精品文档 S2 500V 慢速 1 h 除盐 S3 1000V 快速 1 h 除盐 S4 4000V 线性 3 h 升压 S5 4000V 快速 25000 伏h 聚焦 S6 500V 快速 任意时间 保持 17cm胶条 水化 12h（17-20℃） 主动水化 S1 250V 慢速 2 h 除盐 S2 500V 慢速 1 h 除盐 S3 1000V 快速 1 h 除盐 S4 8000V 线性 5 h 升压 S5 8000V 快速 60,000 伏h 聚焦 S6 500V 快速 任意时间 保持  选择所放置的胶条数。  设置每根胶条的极限电流。  设置等电聚焦时的温度。 7.聚焦结束的胶条如不立即进行平衡、第二向SDS－PAGE电泳，可将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存1-2天。

2.2.2 第二向SDS－PAGE电泳 1.配制12％的丙稀酰胺凝胶，上部留0.5cm的空间，用MilliQ水封面，保持胶面平整。待凝胶凝固候，倒去分离胶表面的MilliQ水，再用MilliQ水冲洗。 2.从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10min，使其溶解。 3.在桌上先放置干得厚滤纸，聚焦好得胶条胶面朝上放在干得厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后置于胶条上，轻轻吸干胶条上得矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现得纵条纹。 4.将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在槽中加入平衡缓冲液Ⅰ。将样品水化盘放在摇床上缓慢摇晃10-15min。 5.第一次平衡结束后，彻底倒掉平衡缓冲液Ⅰ，将胶条竖在滤纸上，吸去多余得平衡液。再加入胶条平衡缓冲液Ⅱ，继续在摇床上缓慢摇晃10-15min。 6.用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余得液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板再下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。 7.第二次平衡结束后，用滤纸吸去胶条上多余的平衡液。用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸没在1×电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。 精品文档 精品文档 8.将放有胶条的SDS－PAGE凝胶转移到灌胶架上，短板一面对着自己，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。 9.用镊子或平头的针头轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡，同时操作时注意不要碰到胶面。 10.放置5min，低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后，将凝胶转移至电泳槽中。 11.电泳起始时用低电流（7cm胶条：5-10mA/gel；17cm胶条：10mA/gel）或低电压(7cm胶条：50-75V/gel；17cm胶条75-100V/gel)，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，在加大电流(7cm胶条：10-15mA/gel；17cm胶条：20-30mA/gel)或电压(7cm胶条：150-200V/gel；17cm胶条：300-400V/gel)，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。 12.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以做记号。然后进行染色。

2．3染色方法 2.3.1考马斯亮蓝G-250染色 固定液：45％（V/V）甲醇，1％（V/V）乙酸 G-250染色液：17％（W/V）硫酸铵，34％（V/V）甲醇，0.5％（V/V）乙酸，0.1％（W/V）G-250. 步骤：1.固定液固定20min或过夜（无需固定液可）。 2.倒出固定液 3.加入G-250染色液，18-24h。 4.倒出染色液 5.用水洗（20min一次，45～55℃温水有助于水洗） 6.可用塑料包裹，4℃贮于密封盆里。

2.3.2胶体考染法 1.用去离子水清洗凝胶两次，每次10min，以去除SDS。 2.固定：50％乙醇/10％冰醋酸/的水溶液，至少30min,可过夜。 3.染色：染色液为45％甲醇/10％冰醋酸/0.25％G-250溶液过滤所得，将凝胶浸泡后染色至少2h。 4.脱色：多次更换脱色液（25％乙醇/8％冰醋酸溶液）直至背景脱净。 5.保存：用保险膜包裹，可存一个月。

2.3.3银染法 步骤 试剂 体积（ml） 不同类型胶所需时间(min) 1mm 1.5mm 1.固定 10％乙酸 / 40％乙醇 / 水 2×250 2×15 2×60 精品文档 精品文档 2.敏化 75ml乙醇 / 17g乙酸钠 / 10ml 5% Na2S2O3 / 250 30 60 1.25ml戊二醛 / 加水至 3.水洗 去离子水 3～5×250 3×15 5×8 4.银染 25ml AgNO3 (2.5%) / 100μl 甲醛/ 加水至 250 20 60 5.水洗 去离子水 2～4×250 2×1 4×1 6.显色 6.25g Na2CO3 / 100μl 甲醛 7μl Na2S2O3(5%) 250 4 6 7.停止 3.65g EDTA 加水至 250 10 40 8.水洗 去离子水 2～3×250 3×5 2×30

3、 等电聚焦蛋白样品的浓度检测 3．1 Bio-Rad RC DC Protein Assay 微离心管检测方法 （1）将5μl DC试剂S与250μl DC试剂A混合（试剂A’），每份样品或标准溶液需要127μl 试剂A’。 （2）将标准蛋白稀释为3-5份蛋白浓度在0.2-1.5mg/ml范围内的标准溶液，在每次测未知蛋白浓度前绘制标准曲线。（为得到最佳结果，标准蛋白应与样品使用同样的缓冲液） （3）从每份样品或标准蛋白中取出25μl，分别加至清洁、干燥的微离心管中。 （4）向每管中加入125μl RC试剂Ⅰ，混旋后室温放置1min。 （5）向每管中加入125μl RC试剂Ⅱ并混旋，之后在15，000×g速度下离心3-5min。 （6）吸去上清，然后将管子倒置在干净吸水纸上，使溶液彻底被吸干。 （7）向每个微离心管中加入 127μl 试剂A’并混旋，在室温下放置5min或直至沉淀彻底溶解。在进行下一步之前再次混旋。 （8）在每个管中加入1ml DC试剂B，立即混旋，室温下放置15min。 （9）在750nm下读取吸光度，吸光度测定要在1h内完成。

3．2 Bradford法 1、溶液的配制 Bradford储存液 100ml 95% 乙醇 200ml 88% 磷酸 350mg 考马斯亮蓝G-250