文章编号:1001-4829(2002)04-0106-04
收稿日期:2002-09-23
作者简介:唐荣华(1965-),男,广西人,副研究员,在职博士生。主要从事生物工程及经济作物研究。
SSR分子标记的开发技术研究进展唐荣华1,张君诚2,吴为人2(11广西农业科学院经济作物研究所,广西南宁 530007;21福建农林大学作物科学学院,福建福州 350002)摘 要:综述简单重复序列标记(SSR)的特点及在作物遗传图谱构建、品种鉴定及分子标记辅助育种等方面的应用价值。重点描述开发SSR标记的两种方法的基本原理和主要步骤,一种是通过克隆酶切片段和大量测序寻找SSR标记的传统方法,一种是应用SAGE原理不需要克隆的STMP技术。介绍这两种方法在创建小麦或大豆SSR标记中的应用。它们都能有效地开发可扩增出特定位点SSR的PCR引物。关键词:SSR;分子标记;引物开发中图分类号:S188 文献标识码:A
ProgressinthewaytodevelopSSRmolecularmarkerTANGRong2hua1,ZHANGJun2cheng2,WUWei2ren2(1.ResearchInstituteofCashCrops,GuangxiAcademyofAgriculturalSciences,NanningGuangxi530007,China;2.CollegeofCrop
Science,FujianAgriculture&ForestryUniversity,FuzhouFujian350102,China)
Abstract:Thecharacteristicsofsimplesequencerepeats(SSR)anditsimportanceingeneticmapping,varietyidentifyingandmolecularmarker2assistantbreeding,etc,arediscussedinthisarticle.AndtwowayswhichcandevelopSSRmolecularmarkerswiththeirbasicprinci2plesandmainstepsarealsoshowninthisarticle.Oneisthetraditionalwaywhichneedsagreatnumberofcloningofenzyme2cutDNAfragmentsandagreatdealofsequencing,theanotherisanewwaywhichcaneliminatethecloningstepandcanreducemuchmoreworkofsequencingbythebasicprincipleofserialanalysisofgeneexpression(SAGE).TheutilityofthesetwowaysinthedevelopmentofbreadwheatorsoybeanSSRisshown.TheresultsshowedthattheywereeffectiveinthedesigningofPCRprimerstoamplifylocus2specificSSR.Keywords:SSR;molecularmarker;primerdevelopment
所有真核基因组中均含有一类DNA碱基序列,被称为微卫星(LITTandLUTY1989)[1]或简单重复序列(SSRs)(TAUTZetal.1986)[2],它们均由1～6个碱基组成的基本序列串连而成,不同等位基因间的重复数存在丰富的差异,因而是许多真核基因组中普遍存在的遗传标记来源(WANGetal.1994)[3]。微卫星分析的主要技术是聚合酶链式反应(PCR),比之限制性片段长度多态性(RFLP)分析容易得多,而且易于分析自动化。在植物当中,微卫星已被证明在很多物种中是高信息量的,并且是位点特异的分子标记(CONDITandHUBBELL1991,PROVANetal.1996,SMULDERSetal.1997)[4～6]。由于微卫星可在多个等位基因间显示差异,因而在作物的遗传图谱构建,遗传多样性发析,亲缘关系鉴定,
DNA指纹图谱构建,品种鉴定,QTL分析及分子辅助育种中均具有公认的优越性及应用前景。这一分子标记的特殊性及重要性在于其有以下特征:①均匀,随机,广泛地分布于水稻、大麦、小麦、大豆等多种作物基因组中。②SSR序列的两侧顺序常较保守,在等位基因间多相同。③多数SSR无功能作用,增加或减少几个重复序列的重复数不影响生物的正常生长发育,因而在品种间具广泛位点变异,比RFLP及RAPD分子标记更具多态性,尤其对花生、六倍体小麦等用常见分子标记技术检测不出很多DNA片段多态性的作物品种来说,具有更大的研究价值和应用前景。④呈孟德尔式遗传,共显性,因而对个体鉴定具特殊意义。⑤仅需微量组织,即便DNA降解,也能有效地分析鉴定。⑥虽然开始筛选
601西 南 农 业 学 报SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences 2002年15卷4期Vol115 No14重复序列和引物设计过程较慢,但只要确定了引物,
结果稳定。SSR分子标记的开发就是检测出SSR两侧的核苷酸序列作为设计PCR扩增引物的根据,以便在不同品种或不同个体间扩增出多态性SSRDNA片段。本文重点介绍创建SSR标记的常规技术和一种新的改良技术,并以面包小麦为例介绍其应用效果,对其应用前景作一分析。1 常规SSR分子标记开发技术111 基因组文库的构建对提取的基因组DNA进行酶切。酶切一般用两种限制性内切酶,一种是识别位点为6个碱基,如EcoRI(G/AATTC),BamHI(G/GATCC)或者RstI(CT2GCA/G),其中PstI是一种对CNG甲基化敏感的酶,如果识别位点的胞嘧啶被甲基化,则不能切割,可用于特异切割有转录活性的DNA区域;另一种的识别位点为4个碱基,如MboI(/GATC),Sau3A(/GATC)。由于酶切位点较识别位点为6个碱基的内切酶多,因而可得到较小的DNA片段。酶切后的片段在1%琼脂凝胶电泳分离。切下大小为2～5kb或更小的片段,用GenecleanⅡ(Bio101Inc)试剂盒纯化。纯化的片段连接到λ载体如LambdaZapⅡ(Stratagene,LaJolla,CA),Bluescript(Stratagene)等载体上,转化大肠杆菌,如XL22Blue菌株,将转化后的大肠杆菌涂布于含青霉素(100mg/L),X2gal(40μg/L),IPTG(400mg/L)的LB选择培养基上,以便判断连接,转化效果及对克隆的选择。112 带有微卫星克隆的识别和筛选人工合成带放射性同位素或化学发光物质标记的与SSR互补的探针,然后与文库中各个克隆的DNA杂交,鉴定出含有SSR的克隆。需要2～3次重复鉴定以确定目的文库。113 测序筛选出的带SSR序列克隆在作序列分析之前进行预处理:将单个克隆经12h(37℃)液体LB摇动培养后,用QIAwellPlasmidKit(QiagenInc.)分离和提取带插入序列质粒,用作序列分析。序列分析采用ABIdRhodaminesequencingkit,先作PCR反应,经沉淀及变性后在自动的激光荧光DNA测序仪(Pharmacia)上测序。114 引物设计目前多数使用PRIMER015计算机软件(WhiteheadInstitute,Camridage,MA02142)选择引物,主要参数因不同作物和SSR类型而异。一般为:引物长度18～30bp,产物的长度为80～300bp,PCR反应的退火温度为40～60℃。引物3’端有1～2G/C核苷酸,单个引物少于3个核苷酸的互补,
两个引物之间少于连续3个核苷酸的配对,以防止PCR时引物形成二聚物及发夹结构而影响扩增物的产量。115 检测所设计的引物必须经过PCR在对应克隆和基因组DNA中扩增出预计产物才能成为可用的SSR
标记引物。剔除那些两个反应产物片段大小不一致,或非期望片段大小,或有多个片段的引物。MarionS.Rder等[7]利用该技术从含有A、B、
D三个染色体组的六倍体面包小麦基因组中开发出230对微卫星引物,可扩增出279个微卫星。大多数引物对都是基因组特异的,并在三个染色体组之一中只扩增出一个微卫星,只有20%的标记可检测到一个以上的位点。并把93个位点定位到A染色体,115个定位到B染色体组,71个定位到D染色体组。这些标记在连锁图上是随机分布的,但在几个着丝点区域有聚集现象。小麦微卫星的二核苷酸主要重复单位有AG,CA,TA,TC,GT。在大豆中已开发出900多个SSR标记,约700个SSR标记的引物选择设计在(ATT)n两侧,约200个SSR标记的引物选择设计在(CT)n两侧,约30个SSR标记的引物选择设计在(AT)n及其它类型两侧。由于要建基因组文库,并需要对每个克隆进行SSR筛选和鉴定,工作量非常大,找到一个有功能的SSR需要花费大量的人力物力,也需要花费大量的时间,影响了该方法的推广普及。
2 序列标签微卫星整合技术如果在SSR开发过程中省去基因组文库的构建和克隆的筛选,并能在每个克隆质粒的一次测序中获得多个SSR位点的信息,那将会节省大量的费用和时间。M.J.HaydenandP.J.Sharp采用一种新的分子生物学技术———基因表达系列分析(SAGE)原理,构建序列标签文库,用于在目的基因组内进行SSR位点的快速鉴定,从中可开发出微卫星标记。基本原理和具体步骤如下:
(1)基因组DNA酶切:用两种限制性内切酶
(如MseI和PstI)酶切,产生带粘性末端的DNA片
段。(2)连接接头:用T4DNA连接酶把MseI和
PstI两种接头分别连接到所获得的DNA片段上,用QiaQuickPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化连接上接头的DNA片段,并用核酸外切酶Ⅲ处理,降解掉接头未完全接好的DNA片段。
7014期唐荣华等:SSR分子标记的开发技术研究进展