DNA分子标记研究进展第 7 卷第 1 期天津农学院学报 17, 11 N o V o l, 20002000 年 3 月 Jo u rna l o f T ian jin A g r icu ltu ra l Co llege M a rch () 文章编号: 1008- 5394 200001- 0021- 04Ξ分子标记研究进展 DN A1 2 王晓梅杨秀荣 ( )1 天津农学院水产科学系, 天津 300384; 2 天津市植保所, 天津 300112摘要: 分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新的较为理想的遗传标记。

本文概述了几种主要的 DN A 分子标记的基本原理和特点, 同时对它们的优缺点进行了比较。

关键词: 分子标记原理特点中图分类号: Q 75 文献标识码: A遗传标记是基因型的特殊的易于识别的表现形式, 它是生物分类学、育种学、遗传学和物种起源与 1 进化等研究的主要技术指标之一。

理想的遗传标记主要应具备以下几条标准: ?具有较强的多态性;() ?表现为共显性, 因而能鉴别出纯合基因型和杂合基因型; ?选择中性即无基因多效性; ?对主要的农艺性状无影响; ?经济方便和易于观察记载。

传统上一直沿用形态标记, 生物学研究进入细胞水帄后,() 人们开始利用细胞标记作为遗传标记, 该标记是指染色体核型染色体的数目、大小、着丝粒位置等和()带型带、带、带等。

随着同工酶技术的发展, 又广泛应用了从蛋白质水帄反映生物遗传差异的生 C G N化标记。

这三种标记的数目有限, 往往不能满足研究的需要, 并且它们有些是基因表达加工后的产物, 其标记易受环境条件和发育阶段等因素的影响。

进入80 年代, 随着分子生物学及分子克隆技术的发展和完善, 诞生了直接从水帄上进行遗传分析的分子标记, 在人类基因组计划的推动下, 分子标记的 DN A 研究与应用得到了迅猛的发展。

分子标记直接以的形式表现, 不受环境条件和发育阶段的影响, DN A标记的数目多, 多态性高。

并且有许多分子标记表现为共显性, 能提供完整的遗传信息, 当前分子标记已广泛应用于基因组研究的各个方面。

()1 限制性片段长度多态性 , R FL P R e st r ic t io n F ragm en t L en g th Po lym o rp h ismR FL P 是 80 年代中期发展起来的一种最早的分子标记。

1980 年 Bo ste in 首先提出了利用 R FL P 作为标记构建遗传图谱, 直到 1987 年 D o n is K e lle r 等人才构建出第一张人的 R FL P 图谱。

R FL P 是由于分子中限制性内切酶酶切识别序列中出现碱基的插入、缺失、置换、倒位而导致酶切位点的增减所 DN A2, 3 引起的基因型间限制性片段长度的差异。

它的基本原理是: 不同材料的用已知的限制性内切 DN A 酶消化后, 产生许多大小不等的片段, 电泳分离、印迹转移到硝酸纤维膜上, 用放射性标 DN A So u th e rn记的探针与膜上变性的酶切进行杂交, 放射自显影, 即可显示出不同材料的多态性图谱, 即显示 DN A出所分析的序列间的。

目前, 有 2 种方法可进行的分析。

一是上述原理所述, DN A R FL PDN A R FL P其中用作的探针可以是特殊基因的克隆、克隆、随机的基因组克隆和合成的 R FL P DN A cDN A DN A() 低聚核苷酸克隆。

二是对那些分子量较小的样本如线粒体、核糖体等, 可在酶切后 DN A DN A DN A 4 对其产物直接电泳, 将不同大小的限制性酶切片段分离, 从而得到该的图谱。

DN A DN A R FL PR FL P 标记呈孟德尔式遗传, 大多数 R FL P 的等位基因为共显性, 在任何分离群体中能区分纯合基Ξ 收稿日期: 1999211229 ( ) ) ( , 女汉族, 讲师, 硕士, 主要从事分子生物学、组织学等方面的研究工作。

作者简介: 王晓梅 1962-因型与杂合基因型。

标记的数目多且稳定, 可用于构建高密度的遗传图谱。

但该技术在操作过程中涉及了的提取、酶切、电泳分离、探针的制备和杂交等一系列分子生物学技术, 步骤繁杂, 工 DN A So u th e rn() 作量大, 且分析中需要的量大 2, 10 , 因此在很大程度上限制了技术的应用。

DN A ΛgR FL P()2 随机扩增多态 , RA PD R an dom A m p lif ied Po lym o rp h ic DNA DN A是 1990 年由和领导的 2 个研究小组几乎同时发展起来的建立在基 RA PD W illiam s W e lsh PCR 5, 6 () 础上的一种新型的分子标记技术。

它的基本原理是: 采用随机合成的寡核苷酸通常 10 作 DN A bp反应的引物, 对所研究生物基因组进行扩增。

一般说某一引物在真核基因组中可能有 PCR DN A PCR很多的结合位点, 但只有在 4 000 之内, 存在反向帄行的与该引物互补的双链才能将合成的新 , bp DN A 链作下一次合成的模板, 经 35, 40 个循环, 即可得到大量的片段, 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、 DN A染色, 紫外下显示带纹。

EB RA PD探针; ?使用随机引物, 合成引物时无需预知 RA PD 技术具有其自身独特的优点: ?不需要 DN A被研究的生物的基因组序列, 一套引物可用于不同生物的研究; ?RA PD 技术操作简便、快速, 可免去中的克隆制备、同位素标记、杂交等步骤; ?分析所需量少, 每个反应仅需R FL P So u th e rn RA PD DN A样本受限制的情几十纳克的 DN A , 仅为 R FL P 的1ƒ1 000, 1ƒ200, 这对生物早期取样鉴定或在 DN A 况下大有益处。

但 RA PD 技术也有自身的局限性, 主要表现在两个方面。

第一, RA PD 标记为显性分子标记, 因此不能在代区分纯合体与杂合体, 必须进行分析; 第二, 扩增中退火温度较常规的 F 2 F 3 RA PD 反应低, 一般为 36 ?左右, 这样能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对并允许适当的错配, 增大 PCR了引物在基因组中配对的随机性, 提高了对基因组的分析效率, 但是由于采用的引物短, 值DN A Tm低, 扩增结果易受外界因素的影响, 实验的重复性较差, 因此在实验中要严格控制实验条件, 才能得到可重复、理想的扩增效果。

()3 扩增片段长度多态性 , A FL P A m p lif ied F ragm en t L en g th Po lym o rh ism 7 是 1993 年由荷兰公司科学家等人发明的一种分子标记技术, 该技 A FL P k eygen e Zab eau DN A术的基本原理是: 对基因组进行限制性酶切片段的选择性扩增。

主要步骤是: 将基因组进行DN A DN A酶切片段的两端, 从而形成一个带接头的特异片段, 通过接限制性酶切后, 将特定的接头连接在 DN A’ 头序列和引物 3端的识别, 进行扩增, 最终经过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, 通过银染 PCR PCR或放射自显影检测。

技术实际上是将和相结合的一种技术。

该技术既继承了的稳定性, 又具 A FL P R FL P PCR R FL P( )有反应快速、灵敏的特点, 同时克服了和的缺点, 且扩增的带纹多 50, 100 条。

PCR R FL P RA PD的大多数扩增片段与基因组的单一位置相对应, 实验重复性高, 该标记为孟德尔式遗传。

但该技 A FL P术目前在国内多用试剂盒来完成整个实验, 实验成本高; 此外该技术已申请专利, 目前人们只能自由地将该技术用于非赢利性的科学研究, 因此在某种程度上也限制了该技术的应用。

()4 简单序列重复 , SSR S im p le Sequ en ce R ep ea t在真核生物基因组中, 散在分布着由 1, 4 个碱基对组成的简单重复序列, 即它又称为微卫星, SSR()。

序列的侧翼具有保守的序列, 由于重复基数的数目变化大, 因此 DN A m ic ro sa te llite DN A SSR DN ASSR 显示出较强的多态性。

人们把以微卫星 DN A 标记建立的遗传连锁图称为继 R FL P 作图后的第二代遗传连锁图。

1985 年已从人肌红蛋白位点获得了3 核心序列作探针, 与人的酶切后的总 Ieff rey s bp体进行杂交, 得到了杂交带谱, 大多数带纹代表人基因组内不同座位上的卫星它们组合在 , DN A DN A 一起成为人的指纹图, 它有高度的个体差异, 且按孟德尔方式稳定遗传, 此法流行了近 10 , 在法 DN A a8 医鉴定方面作出了贡献。

1993 年和改用小卫星探针显示带谱的方法, 创造了用侧W u T an k sley SSR第 1 期 23? ?王晓梅, 等: DN A 分子标记研究进展翼序列作引物的一部分, 用来扩增重复序列本身, 由于重复序列的长度变化极大, 因此是检测多态性的一种有效的方法。

该技术一般检测到的是一个单一的多等位基因位点, 此标记为共显性, 所得的结果重复性高。

为了提高分辨率, 常使用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳, 它可检测出单拷贝差异。

该标记比 R FL P 8 的多态性更丰富, 且操作上比简便快速, 因此正在被广泛应用。

R FL P ()5 2 SCA R Sequ en ceC h a rac te r ized A m p lif ied R eg io n 标记是 1993 年在技术的基础上发展起来的。

基本流程是: 先作分析, 然后把 SCA R RA PD RA PD 目标的片段回收、克隆和测序, 再根据该序列设计特定引物, 此引物通常包含有原来的引 RA PD RA PD9 物序列, 多为 20, 24 , 再用该引物对所研究的基因组进行扩增, 这样就可以把与原来 bp DN A PCR的片段相对应的单一位点鉴定出来。

该标记为共显性遗传。

由于标记使用的引物长, 因而 RA PD SCA R实验的可重复性高, 因此比和其它利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用要好。

RA PD()6 2单链构象多态性 , SSC P S in g leS t ran d Co n fo rm a t io n Po lym o rp h ism技术的基本原理是根据双链经变性处理后, 进行非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳, 由于SSC P DN A可形成二级结构, DN A 分子在凝胶中的迁移率与其分子量和空间构型有关, 在非变性胶中, 单链 DN A 而这种二级结构与单链 DN A 的序列有关, 且单链 DNA 的迁移率受到其二级结构的影响。