泛素—蛋白酶体途径代谢异常与2型糖尿病发生的关系

随着社会的进步发展，人们生活水平的提高，糖尿病(diabetes mellitus,DM) 的发病率逐年增高。据统计2011年全球糖尿病患者总数约 3.66 亿[1]，到2030 年患病人数预计将达到 5.52 亿，这其中 85%～90%为 2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)， 而中国、印度和美国为世界糖尿病三大国[2]。T2DM以及其相应带来的并发症已成为严重威胁人类机体健康的主要慢性病之一，不仅给患者身心带来巨大困扰，而且增加了患者家庭乃至社会的医疗负担。T2DM主要表现为胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷而非胰岛B细胞自身免疫破坏。然而其确切发病机制尚未明确。近年来，人们发现在肥胖、糖尿病等众多机体代谢紊乱情况下，胰岛素靶器官中泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System, UPS）活性明显上调，并且表现出相应的病理表现[3]，UPS在T2DM及其并发症的发生、发展过程中起了重要作用。现将其机制作一综述。

1. 泛素—蛋白酶体系统的组成

UPS由泛素（ubiquitin, Ub）、泛素活化酶（ubiquitin—activating enzyme, E1 ）、泛素结合酶（ubiquitin—conjugating enzyme, E2）、泛素蛋白连接酶（ubiquitin—protein

ligase, E3 ）、蛋白酶体及其底物（蛋白质）构成，其对靶蛋白的降解是一种三级酶联反应过程。通过UPS，细胞几乎可以对其内在的任何一种蛋白质进行高度特异性的降解，整个过程由底物蛋白的泛素化和蛋白酶体降解两个部分组成[4]【4】。泛素化是对特异的靶蛋白进行泛素修饰的过程，泛素化修饰涉及泛素激活酶 E1、泛素结合酶 E2 和泛素连接酶 E3 的一系列反应。首先在 ATP 供能的情况下，泛素分子 C 端的 Gly 残基与 E1 激活酶上的 Cys

残基结合，将泛素激活；接着，激活酶将活化的泛素分子通过转酰基作用转移到 E2 结合酶的 Cys 残基上，二者以硫酯键连接；之后，随着泛素连接酶识别靶蛋白，E3 连接酶分别结合着携带着泛素分子的 E2 结合酶和待泛素化修饰的底物蛋白，在连接酶的作用下，泛素分子从结合酶上转移到底物蛋白上，完成泛素化修饰。在此过程中，E3 连接酶尤其重要，它决定着泛素化修饰的时间性和特异性。根据连接在靶蛋白上的泛素分子的连接方式和数目，可以将泛素化修饰分为单泛素化修饰和多聚泛素化 【5】。由泛素控制的蛋白质降解具有重要的生理意义，它不仅能够清除错误的蛋白质，还对细胞周期调控、DNA修复、细胞生长、免疫功能等都有重要的调控作用。

1.1泛素(Ub)

Ub是1975 年由 Goldstein首先发现的一种在真核生物细胞内高度保守的多肽，单个泛素分子是由76个氨基酸组成，分子量约85kD , 泛素以共价键与底物蛋白连接，它的主要功能是标记待降解的蛋白质，使其被转运至蛋白酶体，进而发生降解【6】。泛素也可以标记跨膜蛋白，比如受体，将其从细胞膜上除去。泛素分子中散布着7个赖氨酸残基，这些残基可以作为其他泛素共价结合的位点。经过几轮结合后，泛素链将会变得很长，这样有助于对“标记”蛋白的识别【7】。泛素化蛋白可被泛素解离酶识别，而将泛素分子从底物蛋白上水解下来，重复利用【8】。

1.2 参与泛素化降解的酶

E1是一种广泛表达的多肽，大约1100 个氨基酸，含有位置固定的保守的半胱氨酸残基。有2个亚型，是由同一个mRNA 在不同的起始位点翻译而成的，存在于细胞浆和细胞核中。目前在脊椎动物中已发现的E1只有一个，有数目不等的E2和大量的E3；E1酶可以激活所有的E2酶，每个E2酶又可以与多个E3酶相互作用【9】。E1首先与ATP结合，然后与泛素相互作用，催化泛素C端腺嘌呤化并释放焦磷酸，使其C端甘氨酸残基与E1的半胱氨酸残基形成高能硫酯键而获得活性，E1—泛素结合的中间体再将泛素转移给E2s，形成E2-泛素中间体。 E2种类很多，分子量在14—35 kDa之间，存在于细胞质和细胞核中，它的功能是在E1酶激活泛素之后，协助特异性的E3将活化的泛素分子转移到底物蛋白上。E2酶都具有相同的UBC结构域核心，该结构域具有保守性，位于该部位的突变则体现了E2家族的多样性，每个家族在与E3酶作用时则表现出明显的特异性，且这几个家族能够进一步根据位于UBC核心结构域的N端或C端区域的特点加以区分。在高等多细胞生物中，酵母Ubc4/5家族有着明显的保守性；在人类中，UbcH5家族具有此特征，该家族成员可与RING和HECT家族的E3发生相互作用，例如，Ubc6p是内质网上的膜结合蛋白；Ubc4和Ubc5是许多寿命较短的蛋白质降解必需的泛素结合酶【10】。

E3是泛素化过程中最关键的酶，在人类基因组中，有多于 400 种编码 E3s 的基因。E3具有特异性结合靶标蛋白质的功能【11】，到目前为止，E3也是参与蛋白质泛素化反应的唯一可控成分【12】。按介导泛素与靶蛋白的结合方式不同，E3s目前可分为三大类：即含有环指状（RING-finger）结构域的E3s 、含有HECT结构域的E3s类以及含有 U-box结构域的E3s 【13】。含有环指结构域的E3s，中心具有锌指结构域【14】，其不能通过硫酯键直接与泛素连接形成过渡蛋白复合物，而是同时与装载泛素的E2和靶蛋白结合，将泛素直接转移到靶蛋白上【15】，而催化底物蛋白的泛素化，仅起到受体的作用【16】，具有典型的环指结构包括c-Cbl、APC、VCB和SCF等均属于该亚类E3。含有HECT结构域的E3s，这类蛋白都含有一个与乳头瘤病毒相关的 E6-AP 类似的保守结构域 HECT，因此而得名，该结构域大约含有 350 的氨基酸。该类E3s是先将泛素从E2转移到HECT结构域的一个半胱氨酸活性位点上，再将硫脂化的泛素转移到靶蛋白上【17】。这一家族中最早发现的 E3 是人源的 E6-AP【18】【19】，它能够使 P53 蛋白发生多泛素化修饰进而被降解。其他成员，比如 Nedd4、Smurf，在膜蛋白的泛素化依赖的内吞过程中起着重要的作用。含有 U-box结构域的E3s作为一类新的泛素连接酶，直到 2001 年才被广泛接受。U-box 类 E3s在结构上以及作用模式上与

RING-finger E3s 类似，区别在于它们不具有与金属偶合的氨基酸残基【20】，其不与泛素分子形成共价连接，而是通过分子间氢键连接形成隙状结构【21】，催化 E2s 将泛素转移到底物上，可能参与介导底物蛋白被其他E3泛素化后多聚泛素链的组装。U-box 类 E3s 包括

UFD2、CHIP、UIP5 等成员。这三类 E3 酶通过各自不同的作用方式，完成催化底物蛋白泛素化过程中最关键的步骤，而且这一步骤也对蛋白质泛素化之后的蛋白酶体降解或者其它过程起着决定性作用。正因为如此，E3 酶常常受到一系列精密的调控，比如转录水平的调节、翻译后的修饰、自身泛素化等等，以确保细胞内蛋白质的数量处于正常的生理水平。尽管不同类别的E3 酶在泛素化过程中的作用机制有所不同，但总的来讲，都包括了三个阶

段，首先 E3 酶与 E2 酶相互识别和作用，接着 E3 酶与底物的相互识别和作用，最后 E3 酶催化泛素与底物蛋白结合或者泛素链的延长。

1.3蛋白酶体系统

被多聚泛素链标记的底物蛋白最终在蛋白酶体中被降解。在真核生物中，蛋白酶体定位于胞核和胞质内，主要功能是利用蛋白水解酶将不需要的或者错误折叠的蛋白质降解成短的肽段，因此蛋白酶体是细胞内的一种调节某些特定蛋白浓度、降解错误折叠蛋白的机制【22】。26S蛋 白 酶 体 由 20S核 心 复 合 物 ， 和 19S调 节 复 合 物组成，20S 核心复合物约700kD ，呈圆筒形，由外部的两个α 环和内部的两个β 环组成，主要负责蛋白质的降解。 在低等生物如古细菌中，20S 核心复合物由14个相同的α亚基和 14个相同的β亚基组成。在真核生物中，20S 的α 环和β 环分别由7个亚基构成。α环和β环在结构上是类似的，α环形成轴向门控通道，β环形成降解腔。β亚基的活性位点均位于环的内侧，β1、β2和β5 亚基具有水解功能，能够切割酸性残基、碱性残基或者疏水残基C 端肽键。 真核生物的 19S 调节复合物由 9 个蛋白组成，可以分为两个组件：直接与 α 亚基结合的 10

个蛋白构成的基底以及能够识别多聚泛素标签的 9 个蛋白构成的顶盖。10 个基底蛋白中有 6 个是来自 AAA 家族的 ATP 酶亚基，20S 核心与 19S 调节复合物的结合，需要 ATP 与

ATP 酶亚基结合，而 ATP的水解释放的能量，则是泛素化的蛋白质降解所必需的【23】【24】。尽管科学家在该领域做了很多研究，但是直到今年，关于 26S 蛋白酶体的原子结构还是没有彻底解决。

2. 泛素蛋白酶体途径与2型糖尿病

随着科学研究的不断深入，在大多数胰岛素靶器官中，人们已经基本认清胰岛素信号网络的大致骨架结构，即IR/IRSs-PI3K-Akt 通路；然而，对于影响此信号途径的具体分子机制，人们的研究目前却刚刚起步【25】。在胰岛素信号的调控中，除去广泛的磷酸化修饰调控以外，作为细胞内蛋白质降解的重要体系，泛素蛋白酶体途径在2型糖尿病发生中也发挥着重要作用，蛋白质降解对于胰岛素信号传递的影响也是巨大的。早在胰岛素抵抗研究的初期，人们就在胰岛素抵抗的病人或动物模型中观察到，IR和IRS1在其酪氨酸磷酸化普遍受抑制的同时，存在大量的“分子数目缺失”【26】【27】。越来越多的研究表明胰岛素受体底物的泛素化可能导致胰岛素信号通路障碍，是导致2 型糖尿病发生的分子机制。近些年，人们对IRSs 的蛋白质降解得到了一些认识，比如，SOCS1/3作为culling-RING类泛素连接酶的底物识别分子，通过与IRS1和IRS2结合，介导了它们的泛素化降解【28】，进而引起胰岛素抵抗。Balasubramanyam等【29】研究表明泛素蛋白酶体途径可能在胰岛素抵抗的发病分子机制中起到关键作用。Xu 【30】等发现E3泛素连接酶Cullin7能够调控IRS-1的水平，使其发生泛素化而降解，从而引起胰岛素靶器官中IRS-1蛋白丰度的降低，影响胰岛素信号通路使其发生胰岛素抵抗，Cullin7基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞内集聚大量IRS-1，导致细胞生长减弱和出现细胞衰老表型，从而证实IRS-1是Cullin7 的蛋白水解靶标。研究【31】发现β-Arrestin-1可以与IRS-1竞争性结合E3泛素连接酶Mdm2，从而减少Mdm2介导的IRS-1的泛素化和降解，促进磷脂酰肌醇3激酶(P13K)通路的信号转导，改善细胞内胰岛素的敏感性。朱丽【32】等研究指出环指蛋白6（RNF6）作为一种E3连接酶，在肝细胞中高表达可以引起IRS-1的表达下调，这一泛素化过程可能导致胰岛素信号转导障碍。Rome【33】等研究发现在胰岛素抵抗和糖尿病时，肌肉组织、脂肪组织、肝脏和胰腺中胰岛素信号蛋白泛素化降解异常，在胰岛素抵抗、糖尿病发病过程中起着重要作用，在胰岛素敏感的3T3-L1脂肪细胞中的APC蛋白能够募集c-Cbl蛋白与胰岛素受体结合，c-Cbl蛋白充当E3泛素连接酶，使胰岛素受体发生泛素化降解。叶彦【34】等研究表明2型糖尿病时IRS—1蛋白在肝脏中表达水平下调，IRS-1泛素化水平增加是导致胰岛素下游信号分子活性降低，引起2型糖尿病的重要原因。

Juan【35】等研究发现在高脂饲料喂养的C-Cbl基因剔除小鼠胰岛素敏感性显著高于野生型小鼠。而且肌肉中线粒体脂肪氧化酶和乙酰COA羧基酶等多种脂肪代谢关键酶活性显著提高。而c-Cbl是E3连接酶，为酪氨酸激酶受体的负调节因子，可以和蛋白质酪氨酸激酶及其重要的信号分子相互作用，影响细胞内信号转导。Ling【36】等研究发现脂肪中表达TRB3(Tribbles-3)转基因小鼠可通过提高脂肪的氧化磷酸化，减轻食物诱导的肥胖。TRB3可通过泛素一蛋白连接酶(E3)copl(constitutive hotomorphogenie protein 1)促进乙酰COA羧基酶泛素化降解。提示磷酸化和泛素化的转化在脂肪代谢中起关键性作用。

Song【37】等2013年发表在《Nature》上一篇文章表明，作为骨骼肌和心肌中特异性表达的蛋白Mitsugumin53(MG53),在胰岛素抵抗和代谢紊乱模型中，即高脂饮食诱导的肥胖小鼠、db/db 糖尿病小鼠、自发性高血压小鼠及表现为代谢综合征的非人类灵长类动物中，

MG53的表达是上调的。 同时，结果显示，在高脂饮食环境下， MG53基因敲除的小鼠的血压血糖血清胰岛素及血脂( 胆固醇和甘油三酯) 的水平与普通饮食喂养的野生型小鼠或者MG53 敲除的小鼠的水平相比无显著性差异，这表明MG53敲除的小鼠能抵抗高脂饮食诱导的代谢紊乱和心血管并发症，如高血压。揭示了肌肉MG53上调和高脂诱导的代谢综合症发病