收稿日期:2005-01-12基金项目:山东省自然科学基金(Y002D01)和山东农业大学博士基金资助课题。
作者简介:石运庆(1976-),男,硕士,主要从事作物遗传育种研究。
*作者为通讯作者。
文章编号:1002-4026(2005)02-0022-08*综述*DNA 分子标记及其在作物遗传育种中的应用石运庆,牟秋焕,李 鹏,刘保申*(山东农业大学农学院,山东泰安271018)摘要:本文总结了三类DNA 分子标记:(1)以Southern 杂交为基础的分子标记;(2)以PCR 为基础的分子标记;(3)以串连重复的DNA 序列为基础的分子标记。
综述了这几类分子标记在作物品种鉴定与绘制指纹图谱,基因定位与辅助选择育种,杂种优势群的划分与杂种优势的预测和细胞学研究等方面中的应用现状。
关键词:作物;DNA 分子标记中图分类号: S503.2 文献标识码:A伴随着遗传学的发展,遗传标记(genetic marker)经历了形态学标记、细胞学标记、生化标记和DNA 分子标记四个阶段,其中DNA 分子标记诞生于上世纪80年代中期,与其他遗传标记相比,它具有如下优点:(1)直接以DNA 的形式表现,在生物各个组织,各个发育时期都可检测到,不受季节、环境限制;(2)数量极多,遍及整个基因组;(3)多态性高,并且自然存在许多的等位变异,不需专门创造特殊的变异材料;(4)表现/中性0,即不影响目标性状的表达,与不良性状也没有必然的连锁;(5)许多分子标记表现为共显性(codomainance),能够鉴别纯合基因型与杂合基因型,提供完整遗传信息。
分子标记的这些优点,在作物遗传育种的研究与应用中得到了广泛的体现。
1 DNA 分子标记随着分子生物学的发展,相继出现了多种DNA 分子标记。
这些种标记大多以电泳谱带的形式表现,根据它们所用的技术不同,大致分为以Southern 杂交技术为基础的分子标记和以PCR 技术为基础的分子标记。
另外,由于其中有些DNA 标记和重复序列密切相关,所以就把它们单独列为一类,以突出其独特性。
1.1 以Southern 杂交为基础的分子标记限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)是Grodzicker 在1974年提出的。
其基本原理是由于酶识别序列内的点突变或部分DNA 片段的缺失、插入、倒位和易位而引起酶切位点的缺失或获得,导致限制性位点改变,再利用限制性内切酶切割DNA 时,就产生了大量的多态性片段。
基本操作步骤:DNA 的纯化、酶切、凝胶电泳分离DNA 片段、转膜、利用放射性同位素标记的DNA 探针进行Southern 杂交并放射自显影和结果分析。
RFLP 标记具有共显性特点,可以区别纯合基因型与杂合基因型,能够提供单个位点上较完整的资料。
结果稳定可靠、重复性好,特别适合于连锁图谱的建立,如小麦的RFLP 连锁图揭示了在小麦进化过程中,有多条染色体发生过易位[1],如7B S 上一个片段和5AL 上一个片段易位到4A 上,4AL 片段易位到5A 上,而第18卷 第2期2005年6月山东科学S HANDONG SCIENCE Vol 118 No 12Jun 120055AL 末端一个片段易位到7B S 上,6BS 末端易位到2BS 末端。
以前人们通过小麦非整倍体等研究表明,小麦A 、B 、D 三基因组的功能有相同之处,可以相互补偿。
现代RFLP 连锁图则进一步证明,这三个基因组之间基因数目以及基因在染色体上的排列位置都非常一致。
但是由于RFLP 标记对DNA 需要量较大(5~10L g ),所需仪器设备较多,检测步骤多,技术较复杂,周期长,成本高,还需要同位素标记,所以其应用受到了一定程度的限制。
1.2 以PCR 为基础的分子标记1.2.1 随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)RAPD 是1990年Willia ms 和Welsh 发明的一种较为简便的检测DNA 多态性的技术。
它以一个随机的寡核苷酸序列(通常为10个碱基)作引物,通过PC R 对基因组DNA 进行随机扩增,产生大小不同的DNA 片段,再经凝胶电泳分开,进行多态性观察。
RAPD 图谱间的差异可因4种方式产生:¹核苷酸置换造成引物与结合位点无法匹配;º某个引物结合位点缺失;»两引物结合位点间的大片段插入导致间距过大而扩增中断;¼插入或删除改变了扩增产物的大小。
与RFLP 相比,RAPD 方法简便,快速,灵敏度高,DNA 用量少,且不需要同位素标记,安全性好。
RAPD 结果可以提供足够的多态性以分辨种以下的类型[2]。
Nguyen 等[3]利用40个RAPD 引物对15个小麦品种遗传多样性进行了分析。
海林等[4]利用RAPD 标记分析了小麦耐盐种质的遗传多样性,共产生200条扩增片段,多态性片段数为172条,扩增片段的多态性百分率为86%,供试的24份材料相似系数在0.21~0.97之间。
但是RAPD 技术因使用的引物比较短,对反应条件极为敏感,稍有改变便影响扩增产物的重现,重复性较差,稳定性不好。
另外,RAPD 是显性标记,不能区分杂合型和纯合型,无法直接用于基因型分析。
这些不足在一定程度上也限制了它的应用。
1.2.2 扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)它的原理是基因组DNA 双酶切,经PCR 扩增后的限制性片段进行选择。
其基本步骤为:先用两种限制性内切酶(一种为6碱基内切酶,如EcoR Ñ,Pst Ñ等,另一种为4碱基内切酶,如Msel)对DNA 进行酶切,然后在酶切片段上连上一个接头(adapter),根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物,进行特异PC R 扩增,扩增产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测。
AFLP 结合了RFLP 和RAPD 的优点,稳定可靠,重复性好,方便快速,只需极少量的DNA 样品,不需要Southern 杂交,不需要预先知道DNA 的序列信息,而且绝大部分为显性标记,显示的多态性信息量也很高。
因而,非常适合于品种指纹图谱的绘制,遗传连锁图的构建及遗传多样性的研究。
Barrett 等[5]利用AFLP 技术评价适应于西北太平洋旱地生产的春、冬小麦代表品种的遗传多样性,结果表明AFLP 对小麦遗传多样性的研究来说是一种很有效的技术。
美国康耐尔大学的Blair 利用AFLP 技术评价54份水稻品种的遗传多样性,研究其系统发育和分类,并与同工酶生化标记及RFLP 标记比较,发现其结论一致,而且认为AFLP 对于研究水稻品种的遗传变异和构建基因图谱更为理想。
但这种方法需经多步操作,并且费用较高。
1.2.3 序列标志位点(Sequence -tagged sites,STS)STS 技术是一种将RFLP 标记转化为PCR 标记的方法。
它通过RFLP 标记或探针进行DNA 序列分析,然后设计出长度为20个碱基左右的引物,对基因组DNA 进行PCR 扩增寻找多态性。
它的扩增产物是一段长几百bp 的特异序列,此序列在基因组中往往只出现一次,因此能够界定基因组的特异位点。
STS 标记的信息量大,多态性好,是共显性标记,能够鉴定不同的基因型。
张泽民等[6]利用RG 227的RFLP 标记转化的STS 标记对水稻F 1花粉不育基因座位S -c 进行了精细定位,认为RG 227STS 与S -c 紧密连锁,遗传距离为0.3cM,为S -c 座位的图位克隆提供了更加准确和简便的检测手段。
陈松柏等[7]利用STS 标23第2期石运庆,等:DNA 分子标记及其在作物遗传育种中的应用24山东科学2005年记对小麦抗白粉病基因Pm4进行了定位,发现STS410与抗病基因Pm4紧密连锁,并认为STS410可用于小麦抗白粉病基因Pm4的分子标记辅助选择。
目前,STS标记也已经应用在了人类基因组物理图谱作图中。
开发STS标记需要测序,所需费用较高,但是一旦开发了适宜的引物,应用价值很大。
1.2.4序列特异性扩增区域(Sequence Charac terized Amplified Re gions,SC AR)SCAR是在RAPD技术上发展起来的。
其方法是将目标RAPD标记克隆并进行末端测序,根据原RAPD 片段两端的序列设计特定引物(通常为24个碱基),对基因组DNA再进行PCR扩增分析。
SCAR标记是共显性遗传,与RAPD标记相比有更好的稳定性,更高的可重复性。
刘志勇等[8]利用SCAR 标记对小麦抗白粉病基因Pm21进行了分子鉴定和标记辅助选择的研究,并认为SCAR标记是稳定、准确、可靠的DNA分子标记,可以用于标记辅助选择。
邹继军等[9]利用RAPD标记转化成的SC AR标记SCS3620&580对62份大豆灰斑病抗感种质资源进行了研究,检测结果与RAPD标记检测结果一致,并认为SC AR标记兼具RFLP和RAPD的优点,在大豆灰斑病抗病育种中具有广泛的应用价值。
1.2.5酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplified Polymorphic Sequences,C APS)CAPS技术又称为PCR-RFLP。
所用的PCR引物是针对特定的位点而设计的。
其基本步骤是:先进行PC R扩增,PC R扩增产物用限制性内切酶酶切,电泳分析多态性。
与RFLP技术一样,C APS技术检测的多态性是酶切片段大小的差异。
在此基础上又发展出了dCAPS(derived C APS)技术,它是检测单核甘酸多态性的一种良好方法。
钱前等[10]利用CAPS分子标记对水稻脆性突变体基因fp1做了进一步定位,发现C524a与fp1遗传距离为0.4cM。
刘道峰等[11]利用C APS标记对水稻类病变突变体lmi进行了基因定位,发现lmi基因与标记C4135-10共分离,为克隆lmi基因奠定了基础。
1.3以串联重复的DNA序列为基础的分子标记1.3.1简单序列重复(Simple Sequence Repeats,SSRs)SSRs简单序列重复,亦称微卫星DNA(microsatellite DNA)是近年来发展起来的建立在PCR基础上的第二代分子标记,它是一类短的串连重复序列基序(1~6个核苷酸)组成的简单重复序列,均匀的分布在整个真核生物基因组中,两边有保守的DNA序列。
SSRs标记的等位基因变异来源于基因组DNA复制时的滑动引起的重复序列数目的变化,而不是单个碱基的突变、插入或缺失造成的,因而表现出高度的多态性。
SSRs是一种较理想的分子标记,它具有以下一些优点:¹多数为共显性遗传,可以检测纯合基因型和杂合基因型;º变异丰富,多态性高;»随机均匀地分布在整个基因组中;¼快速,可通过PCR迅速测定分析;½所需DNA量少,且对其质量要求不高,即使是部分降解的DNA样品也可以进行分析;¾技术难度低,实验成本较低;¿很多引物序列公开发表易在各实验室广为传播使用等特点。