与形态学标识和细胞遗传标记相比，数 量更丰富，受环境影响更小，检测手段 简便，是一种较好的遗传标记。 血液型和蛋白质型都是基因表达的产物， 局限于反映基因组编码区的遗传信息， 且标记的数量还比较有限，不能很好地 覆盖整个基因组。

4、分子遗传标记

分子遗传标记(molecular genetic
AFLP标记原理
对基因组DNA进行双酶切，在使用的两 种限制性酶中，一种为酶切识别位点为4 碱基的酶，另一种为识别位点为6碱基的 酶。进一步将酶切片段和含有与其粘性末 端相同的人工接头连接，连接后的接头序 列及临近内切酶识别位点就作为以后PCR 反应的引物结合位点，通过选择在末端上 分别添加1~3个选择性碱基的不同引物， 选择性地识别具有特异配对顺序的酶切片 段与之结合，从而实现特异性扩增，最后 用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。

5、理想的分子遗传标记应 具备的特点






遗传多态性高; 检测手段简单快捷，易于实现自动化; 遗传共显性，即在分离群中能够分离出等位基 因的3种基因型。 标记遍布整个基因组； 准确性高，能正确反映动植物的真实遗传，即 标记是经济性状基因，或是与影响重要性的性 状连锁。 实验重复性好（便于数据交换）； 开发成本和使用成本尽量低廉；
同工酶(isozyme)：电泳所可区分的同一 种酶（系统）的不同变化 等位酶(allozyme)：由一个位点的不同 等位基因编码的同种酶的不同类型，其 功能相同但氨基酸序列不同

等位酶分析的过程
材料的采集 研磨和酶的提取 酶的保存 电泳
凝胶制备
凝胶切片
酶的组织化学染色
数据分析
酶谱的记录与分析
生化与免疫遗传标记的特点

最早应用于动植物遗传学研究的分子标 记技术
RFLP的原理





利用限制性内切酶消化基因组DNA，形成大小 不等、数量不同的分子片段， 经电泳分离， 通过Southern印迹将DNA片段转移至支持膜 (尼龙膜或硝酸纤维素膜)上， 然后用放射性同位素(32P)或非同位素 (如地高 辛，荧光素)标记的探针与支持膜上的DNA片 段进行杂交。 不同基因组DNA酶切位点的改变，会使得 RFLP谱带表现出不同程度的多态性。
分子标记类型
目前的分子标记有三类： 第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术， 包括RFLP、DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）、原位杂交（in situ hybridization）等； 第二类是以PCR为核心的分子标记技术，包括 RAPD、简单序列重复标记SSR或简单序列长 度多态性（Simple sequence length polymorphism, 简称SSLP标记）、扩展片段 长度多态性标记AFLP、序标签STS、序列特 征化扩增区域SCAR等； 第三类是基于基因芯片等的一些新型的分子标 记，如：SNP标记、表达序列标签EST标记等。
简单直观，但标记数目少，多态性低，易 受外界条件的影响； 依据它进行选择的准确性差，所需时间较长， 选择效率也较低。
古代形态学标记

公元前4000年，伊拉克的古代巴比伦石 刻上记载了马头部性状在５个世代的遗 传。
伯乐相马
按图索骥
2、细胞遗传标记

细胞遗传标记(cytological genetic marker)
SSR标记的特点
（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；数量几
乎无限。
（2） SSR技术一般检测到的是一个单一的多等位
基因位点。
（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子。
（4）实验重复性好，结果可靠。
（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的
序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。
（三）基于基因芯片等的分子标记
SSR标记的原理
尽管微卫星DNA分布于 整个基因组的不同位置 上，但其两端的序列多 是相对保守的单拷贝序 列。根据微卫星DNA两 端的单拷贝序列设计一 对特异引物，利用PCR 技术，扩增每个位点的 微卫星DNA序列，通过 电泳分析核心序列的长 度多态性。
微卫星分子标记对18份山羊草基因型的扩增结果
1、 单核苷酸多态性（SNP）
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平 上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态 性。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检 测，SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的 差异。检测 SNP 的最佳方法是DNA 芯片技术。 SNP 被称为第三代DNA分子标记技术，随着 DNA 芯片技术的发展，其有望成为最重要最 有效的分子标记技术。
（一）基于分子杂交的分子标记
这类标记利用限制性内切酶酶切不同生物体 的DNA分子，然后用特异探针进行Southern 杂交，通过放射性自显影或非同位素显色技术 揭示DNA的多态性。
1、限制性片段长度多态性 （RFLP）

restriction fragment length polymorphism
AFLP标记的特点
（1）结合了RFLP稳定性和PCR技术高效性的特点，
不需要事先知道DNA序列的信息，可以用于任何
动植物基因组的研究。
（2）多态性丰富。
（方式遗传。
（4）分析成本较高，对DNA的纯度和内切酶的质
量要求也较高。
3、SSR（简单重复序列）标记
2、AFLP（扩增片断长度多态性）标记
AFLP即扩增片段长度多态性，是1993 年由Marc 和Pieter 发明创造的一种DNA分 子标记。 该技术是对限制性酶切片段的选择性扩 增，又称基于PCR的RFLP。鉴于AFLP标 记的多态性强，一次可检测到100~150个 扩增产物，因而非常适合绘制品种指纹图 谱及进行分类研究。
三、DNA分子标记在植物生 物技术中的应用
DNA分子标记是现代植物生物技术中应用的重要工具， 其应用主要包括以下几个方面：
1、构建高密度的遗传连锁图 ：
在经典遗传学中由于遗传标记的数量较少， 只能建立稀疏且分布不均匀的遗传连锁图。DNA分 子标记数量丰富，为高密度遗传图谱的制作提供 了可能，促进DNA指纹的分析。
2、进行基因定位：
基因定位就是寻找与目的的基因紧密连 锁的遗传标记并确定其在染色体上的位置， 高密度遗传连锁图的建立使目的基因的定位 更为方便。
二、分子遗传标记


（一）基于分子杂交的分子标记（如： RFLP：限制性片段长度多态性 等） （二）基于PCR 技术的分子标记（如： 随机扩增多态性DNA标记（Random amplification polymorphism DNA, RAPD 等） （三）基于基因芯片等的分子标记（如： SNP：单核苷酸多态性 等）
1.RAPD（随机扩增多态性DNA）标记
Williams等于1990年创立。其基本原理与 PCR技术一致。RAPD标记技术就是用一个 （有时用两个）随机引物（一般8-10个碱基） 非定点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分 开扩增片段。遗传材料的基因组DNA如果在特 定引物结合区域发生DNA片段插入、缺失或碱 基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发 生相应的变化，导致PCR产物增加、缺少或发 生分子量变化。若PCR产物增加或缺少，则产 生RAPD标记。
遗传标记技术及应用
夏海武
一、遗传标记的发展
1、形态学标记 2、细胞遗传标记 3、生化与免疫遗传标记 4、分子遗传标记

5、理想的分子遗传标记应具备的特
点
1、形态学标记

形态学标记(morphological marker)
能够用肉眼识别和观察、明确显示遗传多 样性的外观性状。

特点
RFLP示意图
限制性片段的制备
电
泳
Southern 印 迹
与放射性探针杂交
放射性自显影
RFLP的特点：（1）遍布于整个基因组，
数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受发 育阶段及器官特异性限制；（3）共显性，可区 分纯合子和杂合子；（4）结果稳定、可靠；（5） DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规 模的育种实践中。
对分子标记中共显性的理解
（二）基于PCR 技术的分子标记
PCR技术的特异性取决于引物与模板DNA的特异 性结合，按照引物类型可分为： ①单引物PCR标记，其多态性来源于单个随机引物作用 下扩增产物长度或序列的变异，如：随机扩增多态性 DNA标记（Random amplification polymorphism DNA, RAPD）等技术； ②双引物选择性扩增的PCR标记，主要通过引物3′端碱基 的变化获得多态性，这种标记主要是扩增片段长度多 态性标记（Amplified fragment length polymorphisms, AFLP）； ③基于特异双引物PCR的标记，如简单系列重复标记 （Simple sequence repeats, SSR）等。
marker) 是一种新的以DNA多态性为基础的遗传标 记. 随着分子生物学的发展，相继建立了RFLP、 RAPD、AFLP、SNP等多种分子遗传标记 检测技术，开创了遗传标记研究的新阶段。
分子遗传标记的特点
分子标记指能反映生物个体或种群间基因组 中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因 组DNA间的差异。分子标记的优越性表现为： （1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各 个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、 环境限制，不存在表达与否等问题；（2）数 量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无 限；（3）多态性高，自然界存在许多等位变 异，无须人为创造；（4）表现为中性，不影 响目标性状的表达；（5）许多标记表现为共 显性的特点，能区别纯合体和杂合体。

3、生化与免疫遗传标记