全血胆碱酯酶活性的测定

——羟胺三氯化铁法

实验目的

1. 掌握三氯化铁比色法的实验原理、分析步骤及酶测定的临床意义。

2. 了解常见全血胆碱酯酶活性测定方法的优缺点、注意事项。

3. 学会末梢血的采集。

实验原理

血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱和碱性羟胺反应，形成红色羌酸铁络合物。颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。

试剂和材料

蒸馏水

盐酸溶液(1＋2)

碱性羟胺溶液

磷酸盐缓冲液(PH＝7.20)

三氯化铁溶液

氯化乙酰胆碱标准液 分光光度计

10mL比色管

漏斗

恒温水浴箱，控温±0.5℃

采血针头

血色素吸管

采样、运输和保存

用血色素吸管，取指血20μL，注入比色管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立即进行测定。

实验步骤

A 样品管+0.98mL 磷酸盐缓冲液+0.02mL全血

37℃水浴

5min

+1.0mL乙酰胆碱应用液 37℃水浴 30min

B 对照管0.98mL磷酸盐缓冲液+0.02mL全血 37℃水浴 5min

+1.0mL水 37℃水浴 30min

C 标准管1.0mL 磷酸盐缓冲液 37℃水浴 5min + 1.0mL乙酰胆碱应用液 37℃水浴 30min

D 空白管1.0mL 磷酸盐缓冲液 37℃水浴 5min +1.0mL水

37℃水浴 30min

水浴之后对A、B、C、D四个试管分别进行以下操作：

1.加入 4.0mL 碱性羟胺溶液，充分振摇 2min；

2.加入 2.0mL 盐酸溶液，充分振摇 2min；

3.加入 2.0mL 三氯化铁溶液，充分振摇；

4.滤纸过滤，520nm比色。

实验结果

表1-1 520nm波长下样品的吸光度

样品编号 A B C D

吸光度 0.299 0.003 0.538 0.000

结果计算

①计算酶活性的绝对值

带入得： Xs=7538.0299.0003.0538.0=3.149μmol

Xs：水解乙酰胆碱的浓度，μmol(0.02mL·37℃·30min)；

A：以试剂空白为参比的在波长520nm处样品管的吸光度值；

B：以试剂空白为参比的在波长520nm处对照管的吸光度值；

C：以试剂空白为参比的在波长520nm处标准管的吸光度值。

②计算酶活性的相对值

Y=10060.1149.3=197

Y—酶活性的相对值，%；

Xs—被测血样中酶活性的绝对值，μmol(0.02mL·37℃·30min)；

Xc—正常人血中酶活性绝对值，μmol(0.02mL·37℃·30min)。Xc=1.60μmol(0.02mL·37℃·30min)

讨论

1.由于未在网上查到北京市居民胆碱酯酶活性的参考标准，遂以课件上浙江地区健康人胆碱酯酶活性绝对值作为参考。即：女：3.19 ± 0.398 μmol ；因3.149μmol在3.19 ±

0.398 μmol的区间内，故该样本的胆碱酯酶活性属正常范围。

2.各组所测数值偏差较大，可能与操作差异如采血时间、振摇是否充分、加热时间等导致胆碱酯酶活性变化有关。

3. 采血要迅速，防止凝固及氧化；振摇要充分，同时防止液体溅出；比色时有以D管调零。

注意事项

1.采血前应准备好试管，提前加入磷酸盐缓冲液；

2.采血时严格消毒，用过的采血针放入利器筒中，棉签放入垃圾桶中，不可混放；

3.准确控制水浴的温度和时间，否则会影响实验结果；

4.加入三氯化铁显色后，20 min内比色。