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二、实验原理
酶的竞争性抑制作用
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抑制剂和底物的结构相似，可与 底物竞争酶的活性中心，阻碍酶-底 物复合物的形成。
抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力以及抑 制剂与底物浓度的相对比例（[I]/[S]）
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HOOC—CH2—CH2—COOH
FAD
MBH2甲烯白（无色）
草酸
琥珀酸脱氢酶 HOOC—COOH
HOOC—CH=CH—COOH
FADH2
MB甲烯蓝（蓝色）
在无氧条件下，以甲烯蓝褪色时间来判断琥珀酸脱氢 酶活性的改变。
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实验器材与试剂:
（一）试剂 pH=7.4的磷酸缓冲液 0.25%琥珀酸钠溶液 0.5%草酸钠溶液 0.01%甲烯蓝溶液
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思考题：
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5：本试验在设计上存在某些缺陷，指出存在的缺 陷与改进方案？
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补充：
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琥珀酸脱氢酶（Succinatedehydrogenase，简 称SDH），黄素酶类，是线粒体内膜的结合酶， 属膜结合酶，是连接氧化磷酸化与电子传递的枢 纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需 氧和产能的呼吸链提供电子，为线粒体的一种标 志酶。 琥珀酸脱氢酶有两种，一种是以泛醌作为受 体的，另一种是作用于所有受体。
0.50
——
0.50
2.00
0.50
——
0.50
0.50
0.50 —— 1.00 0.20
2.00 —— 1.0 0.20
2.00 1.00 0.20
2.00 1.00 0.20
1.50 1.00 0.20
摇匀，静臵于37摄氏度的水浴中（此后再勿摇动）注意观察各管的颜色变化，记 录各管颜色消退的顺序和时间，分析原因，振荡褪色的反应液，观察实验现象并 分析产生该现象的原因。
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琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
由PowerBar模板组提供

实验目的：
(1) 学习动物的处死与组织匀浆的方法。 (2) 学习离心机的使用方法。
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(3) 进一步理解酶的竞争抑制原理。
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实验原理：
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竞争性抑制是指分子结构与底物相似的抑制剂可与底物竞 争性结合酶的活性中心，抑制酶的活力。竞争性抑制剂的 抑制程度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相对比例。 草酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争 性抑制剂。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。 在体内，琥珀酸脱下的2H 经电子传递链传递，最后与氧 结合生成水，并释放出能量。在体外则可用甲烯蓝（蓝色） 作为受氢体，甲烯蓝接受琥珀酸脱下的2H 而被还原为甲 烯白（无色）。在甲烯兰含量一定的条件下，蓝色消退的 快慢程度可指示琥珀酸脱氢酶的活力，因此，可依据蓝色 消退时间来判断该酶活力被抑制的程度。
分批加入磷酸缓冲液，边加边磨，总共7ml


搅匀后倒入圆底离心管，离心3分钟
将上清液倒入一支试管中备用，即为含有琥珀酸脱氢 酶的肝糜液
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实验操作：
另取中试管5支，标号 琥珀酸脱氢酶活力的测定
编号 1 2 3 4 5
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0.25%琥珀 酸钠溶液 /ml
0.5%草酸 钠溶液/ml 蒸馏水/ml 肝糜液/ml 甲烯蓝/ml
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生理盐水
液体石蜡
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实验器材与试剂：
（二）器材 研钵.手术剪.手术镊子
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2mL移液管
1000 uL微量可调仪器
10mL离心管
低速离心机
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实验操作：
(1)肝糜液的制备 用颈椎脱臼法处死小白鼠
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将肝脏取出臵于研钵，用生理盐水洗净，剪碎肝脏充 分研磨至糊状
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2.铁氰化钾[K3Fe（CN）6]还原法 以铁氰化钾[K3Fe（CN）6]和琥珀酸钠为底 物，使琥珀酸脱氢酶催化反应将铁氰化钾还原为 亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6]，K4Fe（CN）6再与 Fe3＋作用生成普鲁士蓝，在700nm波长测定吸 光值，以检测普鲁士蓝之生成量，作为琥珀酸脱 氢酶的还原力，吸光值愈高表示琥珀酸脱氢酶活 力愈强。
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注意事项：
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1>肝脏一定要充分研磨至糊状，一使琥珀酸脱氢 酶尽量释放到溶液里
2>离心时注意离心管一定要精确平衡，并将重要 相等的离心管对称放臵
3>离心结束后拿取离心管时动作要轻柔，不要振 荡离心管，以免肝糜液重新变浑浊
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思考题：
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1:为什么反应开始后，反应液必须静止，不能在 摇动?
避免空气中的氧接触反应溶液，使的还原性的甲 烯白重新氧化成甲烯蓝
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思考题：
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2:本实验为何选择肝脏来提取琥珀酸脱氢酶？本 实验成功的关键是什么？
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思考题：
3：抑制剂还可以选用什么物质？ 还可以选用丙二酸
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4：利用本实验的数据，说明酶竞争性抑制的特点 ？ 竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物 ；b.抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部 位相同；c.抑制剂浓度越大，则抑制作用越大； 但增加底物浓度可使抑制程度减小；d.动力学参 数：Km值增大，Vm值不变。
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琥珀酸脱氢酶活力测定方法目前主要有五种
1.硫酸甲酯吩嗪（PMS）反应法
2.铁氰化钾[K3Fe（CN）6]还原法
3.TTC（氯化三苯四氮唑）法
4.MTT法 5.NBT（氯化硝基四氮唑蓝）法
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1.硫酸甲酯吩嗪（PMS）反应法
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琥珀酸脱氢酶能通过一系列人工电子受体，如与PMS（吩嗪二 甲酯硫酸盐），DCPIP（2，6-二氯酚靛酚）等发生反应催化 琥珀酸的氧化，而借助这些中间产物的颜色变化，通过分光光 度计检测即可加以定量反映，其反应式为：①Succinate＋ PMS→Fumarate＋PMSH2；②PMSH2＋DCPIP→PMS＋ DCPIPH2。DCPIP呈蓝色，标准的吸收光谱在600nm处，这 种色泽可因其还原而渐次变淡，从而600nm处的光密度的变化 与DCPIP含量成正比，测定2.6-DPIP的还原速度可以推算出 SDH的活力。一分子DCPIP被还原，即代表一分子琥珀酸被氧 化。故可测定此反应系统在600nm处的吸收光度变化，来计算 SDH的活性。SDH活性计算：（标准－测定）/标准 =μmol/min/mg。