HEREDITAS (Beijing) 2007年9月，29(9): 1097―1102 ISSN 0253-9772 研究报告收稿日期: 2007−02−09; 修回日期: 2007−03−13基金项目: 国家自然科学基金项目(编号：30371087)和国家高技术研究发展计划(863计划)项目资助(编号：2006AA10A119) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 30371087) and the National Hi-Tech Research and Development Program (863) of China (No. 2006AA10A119)]作者简介: 刘岩(1976−), 女, 河南温县人, 助研, 博士, 研究方向：昆虫分子生物学。

E-mail: mayanly@ 通讯作者: 孟智启(1953−), 男, 浙江杭州人, 研究员, 研究方向：昆虫分子生物学。

E-mail: mengzq2001@DOI: 10.1360/yc-007-1097家蚕MLP 基因的克隆及其结构分析刘岩, 牛宝龙, 翁宏飚, 沈卫锋, 何丽华, 齐晓朋, 孟智启浙江省农业科学院蚕桑研究所, 杭州 310021摘要: 利用生物信息学的方法快速获得家蚕MLP (Muscle LIM protein, MLP)基因cDNA 电子序列, 经RT-PCR 生物验证正确, 登录GenBank (No. DQ311195)。

MLP 基因cDNA 长2 327 bp, ORF 全长1 485 bp, 编码产生494个氨基酸。

该MLP 基因组DNA 含有11个外显子, 10个内含子, 所有内含子/外显子边界都符合典型的GT/AG 剪切模式。

MLP 基因编码的蛋白富含Gly (14.4%), 分子量约为53.03 kDa, 等电点(PI )为8.29。

通过BLAST 分析发现该基因编码的家蚕肌肉LIM 蛋白, 含有5个保守的LIM 结构域, 家蚕的另一种LIM 蛋白(AAR23823)含一个LIM 结构域, 两者可能是通过可变剪切产生; 后者可能通过竞争作用调节前者在肌细胞中的功能。

MLP 的克隆为进一步研究其体内功能奠定了基础。

关键词: 家蚕; MLP ; 表达序列标签(EST); LIM 结构域Cloning and structural analysis of MLP in the silkworm, Bombyx moriLIU Yan, NIU Bao-Long, WENG Hong-Biao, SHEN Wei-Feng, HE Li-Hua, QI Xiao-Peng, MENG Zhi-QiSericulture Research Institute , Zhejiang Academy of Agricultural Sciences , Hangzhou 310021, ChinaAbstract : The LIM domain is found in a wide variety of eukaryotic proteins that regulate gene expression and cell differ-entiation during development. Muscle LIM protein (MLP ) gene in Bombyx mori has been cloned by blasting its EST data-base and PCR test in present report. The resulting sequence covers 2 327 bp of cDNA (GenBank accession No. DQ311195). It has a complete open reading fragment and encodes a 494 amino acid protein. Genomic DNA sequence contains 11 exons and 10 introns, with intron splicing following the GT-AG rule. M.W. and PI of the predicted MLP in Bombyx mori are 53.03 kDa and 8.29 respectively. A single LIM domain linked to a glyscine-rich region is found in a previously deposited LIM protein (AAR23823) in Bombyx mori . MLP identified in this report encodes a protein with five tandem LIM-glycine modules. The two LIM proteins could be produced by alternative splicing and both are probably involved in muscle cell differentiation. This work provides foundation for further research on the in vivo function of MLP.Keywords: Bombyx mori ; MLP ; expression sequence tag (EST); LIM domainLIM 是3种转录因子线虫Lin-11、鼠Isl-1和线虫Mec-3名称首字母的缩写[1,2]。

LIM 家族蛋白都含有一个或多个保守的LIM 结构域。

LIM 结构域是由一段富含半胱氨酸的(CX2CX16-23HX2CX2CX2C- X16-23CX2-3(C/H/D))序列组成[3,4], 其中保守的半胱氨酸、组氨酸及天冬氨酸残基形成具有Zn 2＋结合1098 HEREDITAS(Beijing) 2007第29卷口袋的稳定的三级结构[4~7]。

借此结构域, LIM蛋白参与蛋白质与蛋白质之间的相互作用, 调节胚胎发育、细胞分化和细胞骨架形成等。

LIM家族蛋白可以分为两大类: 一种是与功能结构域相关的LIM蛋白, 包括LIM同型域蛋白(LIM homeodomain, LIM-HD)和LIM激酶(LIM kinase, LIM-K); 另一类就是只含有LIM结构域的蛋白质(LIM only protein, LIMO)。

CRP家族蛋白有两种形式的LIM结构域, 每个都含一富含甘氨酸的LIM区域[8,9], CRP家族蛋白参与脊椎动物肌肉细胞分化。

MLP(muscle LIM protein)属富含半胱氨酸蛋白(cysteine rich protein, CRP)家族, 参与肌肉的分化[10]。

Stronach等[11]在果蝇中鉴定出两种MLP蛋白, Mlp60A蛋白含一个富含甘氨酸的LIM结构域, Mlp84B蛋白含有5个富含甘氨酸的LIM 模块。

Hwang等[12]克隆到一种长622 bp的家蚕LIM 同源蛋白的cDNA, 它编码产生94个氨基酸的家蚕LIM同源蛋白, 该蛋白含有1个甘氨酸丰富的LIM结构域。

除此之外, 人们对家蚕LIM相关基因的了解仍很有限。

为探究家蚕基因组是否含有5个LIM结构域模块的Muscle LIM protein, 本文以果蝇的MLP基因序列为信息模板, 对家蚕EST库进行同源比对, 经过反复的延伸和比对, 获得了家蚕MLP基因的全长cDNA序列; 经生物验证并对MLP基因结构进行了分析。

1材料和方法1.1试剂与菌种DNA连接试剂盒购自TaKaRa(大连)公司; 质粒提取和胶回收试剂盒购自上海鼎国公司; RNA提取试剂盒购自V-gene; DNA Marker、Taq DNA Ploymerase、dNTP Mix购自TaKaRa(大连) 公司; RevertAid TM M-MuLV Reverse Transcriptase和RNase抑制剂购自Fermentas公司; 宿主菌E. coli TG1由本实验室保存。

1.2供试材料蚕由浙江省农科院蚕桑所蚕种室提供, 品种为P50。

1.3 MLP基因的快速电子拼接电子克隆根据物种间同源基因的核酸序列相对保守并有一定同源性的特点, 以果蝇Mlp84B同源基因的cDNA序列为模板, 用BLAST(http://www.ncbi. /BLAST/)程序检索GenBank中的家蚕EST公共序列, 把检出序列拼接成contig后, 以此contig为被检序列再次进行Blast, 重复上述操作, 直至所有检出的重叠EST或连续体序列不能继续延伸[13,14]。

最后对获得的电子克隆基因(家蚕MLP)的特性进行初步分析。

1.4 MLP拼接基因的生物验证1.4.1 引物设计根据电子克隆所得的家蚕MLP基因序列, 利用Primer premier(version 5.0)软件设计引物P1~P4 (表1), 其中引物P1/P2用于扩增和P3/P4引物对分别用于扩增MLP基因的上段和下段。

1.4.2 家蚕组织总RNA的抽提取蚕蛹(P50)数只, 置入研钵内; 迅速加入液氮并研成粉末, 然后加入1 mL Trizol, 用研钵棒混匀后移入1.5 mL离心管中; 4℃, 12 000×g离心5 min, 将上清移入一新的1.5 mL离心管中; 加入200 µL氯仿, 涡旋器上振荡混匀30 s, 室温放置2～3 min, 4℃, 12 000×g离心15 min; 将上清移至一新的1.5 mL离心管中, 加入0. 0.5 mL异丙醇, 室温放置10 min, 4℃, 12 000×g离心10 min; 移去上清液后加入1 mL 75％乙醇, 涡旋器上振荡后4℃, 7 500×g离心5 min后, 弃去上清; 待稍干后, 加入适量RNase- free HB2O溶解备用。

1.4.3 RT-PCR扩增家蚕MLP基因RT参照Fermentas公司试剂操作说明书步骤进行。

表1实验所用引物Table 1 Primers used for PCR引物名称Primer引物序列Sequences(5′→3′)引物长度Length of rimer (bp)产物名称Product产物大小Length of product (bp)P1 CAATGCCTTTCAAACCCGCTGATA 24P2 GCAGTATCAATCACGGTGGTCTTAG 25MLP-up 628 P3 CTAAGACCACCGTGATTGATACTGC 25P4 AAACTAAGGGCCCAGACACA 20MLP-down 1,164第9期刘岩等: 家蚕MLP基因的克隆及其结构分析 1099以实验家蚕的cDNA为模板, 用设计的引物扩增特异性片段。