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微分干涉（DIC）显微成像
埋植于铜架中的铌-锡超导丝束
(a) 明场成像，黑色区域为制作过程中残留的锡，蓝色的一层为钽
(b) 暗场成像，超导丝和钽层没有成像，而残留的锡反射光成像，形成包围 超导丝的金属环带
(c) 微分干涉衬成像，铜架清晰可见，但残留的锡和钽层却看不到
不同成像方法相互补充
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微分干涉（DIC）显微成像
增大数值孔径
增大n值——使用水镜或油镜等
/immersionoilmicroscope.shtml
Air = 1 Water = 1.33 Oil ≈ 1.51
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显微成像基本概念
• 横向分辨率
分辨率公式取决于整个显微成像过程中 各个光学部件参数，经过一系列理论推 导得到，且与样品对比度和实际照明的 效果有关 减小波长——使用短波长光源 Practical Resolution (as well as NA):
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相差物镜 在物镜后焦面处加入涂有氟化 镁的相板；延迟相位以区分直 射光和衍射光，使光程差转换 为振幅差。
•
• • •
反射光物镜
数值孔径可调物镜 超低放大倍数物镜 长工作距离物镜
显微镜的基本结构与部件
• 目镜 作用：对物镜放大的实像（中
间像）再放大
SW：大视野 UW：超大视野 H：高焦点，允许观察者戴眼镜 26.5：视场数（单位mm）
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显微镜的基本结构与部件
光源 聚光镜 物镜 目镜 探测器
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显微镜的基本结构与部件
• 光源：白炽灯
卤素灯，是目前显微镜最常用的白炽灯光源之一，发射的是连续光。
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显微镜的基本结构与部件
• 光源：弧光灯
汞灯和氙灯较为常用。
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显微镜的基本结构与部件
• 光源：激光
荧光显微镜，共聚焦显微镜，双光子荧光显微镜，荧光寿命成像显 微系统，都需要使用激光光源。 分为：固体激光器，气体激光器，染料激光器，半导体激光器等
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显微镜的基本结构与部件
∞：筒长 0.17：配用的盖玻片厚度（单位 mm） WD 0.21：工作距离（单位 mm）
盖玻片厚度不标准，光从盖玻片 进入空气产生折射的光路发生改 变，产生相差，即覆盖差 盖玻片标准厚度为0.17 mm，许 可范围为0.16-0.18 mm，物镜在 制造上已将些厚度范围内的相关 计算在内
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显微镜的基本结构与部件
• 聚光镜：使用数值孔径0.40以上的物镜时，必须具有聚光镜。
作用：
•
• • •
将光聚焦于样品，得到最好的照明效果 弥补光量不足
适当改变光性质 是科勒照明的重要组成部分
种类：
• • •
•
阿贝聚光镜 消色差聚光镜 消球差聚光镜 消色差/消球差聚光镜
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显微镜的基本结构与部件
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显微镜的基本结构与部件
校正像差
Plan：平场 校正场曲，提高视场边缘成像质量 Ach：消色差 校正光轴上的位置色差（红和蓝 光）、球差（黄绿光）和正弦差 Apo：复消色差 校正光轴上的位置色差（红和蓝）、 球差（红和蓝光）和正弦差，以及 二级光谱（校正绿光的位置色差） Fluor：萤石（半复消色差） 成像质量介于消色差物镜和复消色 差物镜之间
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显微镜的基本结构与部件
60x：放大倍数 1.40：数值孔径 浸法特征： Oil：油浸 WI：水浸 Gly：甘油 MI：混合
减小玻片和物镜成像介质间的折射率 差异，提高数值孔径
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显微镜的基本结构与部件
特殊光学性质 DIC：微分干涉衬式 H：与专用Walloston 棱镜 配用达到最优放大 D：暗视野式 PH：相差式 POL：偏振光式 SF：无应变式 M ：金相（无盖玻片）
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显微镜分类
• 照明方式
明场显微镜 暗场显微镜
• 光学原理
相差显微镜 偏振（偏光）显微镜 微分干涉衬显微镜 （DIC）
• 成像原理或结构
荧光显微镜 共聚焦显微镜 多光子显微镜
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提 纲
• 显微光学系统的基本理论 • 明场和微分干涉（DIC）显微成像 • 荧光显微成像 • 共聚焦、双光子激发荧光显微成像 • 荧光寿命显微成像 • 超分辨显微成像
武汉磁共agnetic Resonance in Wuhan
生物磁共振分析重点实验室
Key Laboratory of Magnetic Resonance in Biological Systems
显微光学成像
报告人：徐玲玲 电 话：13377885232 E-mail：xll@
d a db d c
提高 分辨率
增大NA值——使用高NA值的 物镜 增加明暗反差
Abbe定律：光学显微镜分辨率极限约
为200 nm
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显微成像基本概念
• 纵向分辨率
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显微成像基本概念
分辨率的其他影响因素
分辨率除了与折射率，波长相关外，还与下面一些因素相关： 对比度：足够的染色对比度或是光学对比度 折射率差：镜头的分辨能力必须存在折射率差 样品厚度：分辨率决不会高于样品厚度的~ 1/10 放大倍数 = 物镜放大倍数 × 目镜放大倍数
孔径光阑尺寸
90%
60% 0.54 0.72
炫目感减弱， 图像尖锐，没 有明显的衍射
20% 0.18 0.24
细节衍射和反 射而变模糊， 分辨率下降
孔径光阑N.A. 0.81 与物镜N.A.比 1.08
图像很亮，有 很强的散射和 炫目
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明场显微成像
科勒照明的调节：调节视场光阑和聚光镜
10x物镜
视场光阑和 孔径光阑均 关闭到最小
光学显微镜 ( > 200 nm)
人眼 (>75 m)
DNA double helix, about 2 nm; Eight-cell-stage human embryo three days after fertilization, about 200 μm; A wolf spider, about 15 mm across; Emperor penguins, about 1m tall.
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显微镜的基本结构与部件
工作距离与齐焦距离
工作距离：样品正确聚焦时，物镜前 透镜表面到样品之间的距离 平常所说的调焦实际是调节工作距离 物镜数值孔径越大，其工作距离越小
齐焦：转换物镜时，样品均处于最佳 焦面，且成像中心在一定范围内，即 合轴 齐焦距离：样品到物镜固定螺纹边缘 之间的距离 一般，齐焦距离设定为45 mm，不同厂 家制造的特殊物镜会有所区别
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显微镜的基本结构与部件
特殊物镜种类
• • • • • • 相差物镜 微分干涉衬物镜 Hoffman调制相衬物镜 近红外显微镜用物镜 干涉显微镜用物镜 偏振光物镜
Hoffman调制相衬物镜 提高未染色活体组织的可见度 和对比度；在物镜的后焦面上 装有独特的调制器—空间滤波 器；将相位梯度转换为光强度 变化，使透明的活体标本产生 生动、具有三维立体感的图像。 带校正环物镜 调节配用的浸液； 调节配用的载玻片厚度，校 正覆盖差
视场：从显微镜目镜里看到的明
亮的圆形范围 视场直径 = 视场数 /（物镜放大倍数 ×筒镜放大倍数） 0.53 mm = 26.5 mm /（ 40 × 1.25 ）
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显微镜的基本结构与部件
• 数值孔径（Numerical Aperture， NA ）:是判断物镜和聚光镜性能的 重要技术参数。
样品与物镜间 介质折射率 半孔径角 孔径角：光轴上物体点 与物镜前透镜的有效直 径所形成的角度 为充分发挥物镜数 值孔径，聚光镜的NA 值应等于或略大于物镜 的NA值 增大孔径角——目前最大的能够做到76°
• 物镜
显微镜最重要的光学部件
对样品的第一次成像
直接影响显微镜的成像质量和各 项光学技术参数 衡量一台显微镜质量的首要标准
Achromatic：消色差 Fluorite：萤石 Apochromatic：复消色差
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显微镜的基本结构与部件
物镜标示与光学参数
生产厂家
Olympus：奥林巴斯 Nikon：尼康 Zeiss：蔡司 Leica：徕卡
DIC显微镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体 等，立体感特别强，适合于显微操作。
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微分干涉（DIC）显微成像
DIC调节简易步骤：
1.科勒照明调节 2.插入起偏器 3. 检查两棱镜是否已加入光 路中 4.插入检偏器，调节检偏器 的角度，直至图像出现浮雕 感。 5. 图像显示为一边明，一边 暗。
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斜射式
明场显微成像
透射/落射式明场照明
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明场显微成像-科勒照明
科勒照明 要点：光源灯丝在聚光镜孔径光阑成像
两组共轭平面
科勒照明的优势： 均匀而又充份明亮的照明 不会产生耀眼的眩光 不会烤焦样品 极为有效的控制被照明的视场及其照 明孔径
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明场显微成像-孔径光阑
改变聚光镜孔径光阑的大小，使光源充满不同物镜的入射光瞳，而使 聚光镜的数值孔径与物镜的数值孔径匹配。 例子： 物镜: 40x/0.75 聚光镜: NA=0.90
不同成像方法的比较：
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提 纲
• 显微光学系统的基本理论 • 明场和微分干涉（DIC）显微成像 • 荧光显微成像 • 共聚焦、双光子激发荧光显微成像 • 荧光寿命显微成像 • 超分辨显微成像
为了充分发挥显微 镜的分辨能力，应 使数值孔径与显微 镜总放大倍率合理 匹配。
Plan Ach 20x 0.4 物镜 10x 光学放大 Plan Ach 4x 0.1 物镜 50x 光学放大
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