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州　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｎｅｖｈｒｏｌ，Ｏｃｍｂｅｒ　ｌ９９８，Ｖｏ１．１４　Ｎｏ　５　

２　７王一２ｙｒ　急进性肾炎中抗肾小球基底膜抗体的检测及其Ｉ临床意义　刘娜赵明　章友康郑欣王海燕　，　ｅ岬　

目的了解急进性肾炎（ＲＰＧＮ）中抗肾小球基底膜（ＧＢＭ）抗体的发生宰及其临床意义。方法　自行制备可　溶性人ＧＢＭ抗原，应用酶联免疫吸附方法（ＥＬＩＳＡ）对２９例ＲＰＧＮ患者进行抗ＧＢＭ抗体的检测，并对用性血清用　免疫印迹法进行鉴定、验证。结果２９倒ＲＰＧＮ患者中５倒抗ＧＢＭ抗体阳性，占１７％，其中一例伴ＡＮＣＡ阳性。　免疫印迹法证实均识别２３．２７ＫＤ，柏．５４ＫＤ的蛋白条带。３／４倒免疫荧光呈现免疫复合物细颗粒样沿ＧＢＭ沉积。　结论抗ＧＢＭ抗体型ＲＰＧＮ在我国并不少见，用ＥＬＩＳＡ法检铡抗ＧＢＭ抗体特异性高而且较间接免疫荧光方法　（Ｉ１Ｆ）更灵敏。应早期对所有ＲｐＧＮ患者进行常规抗ＧＢＭ抗体检测。　美键词急进性肾小球肾炎　肾小球基底膜　自身抗体免疫印迹法　Ａｎｔｂｇｌｏｍｅｒｎｌｍｒ　Ｉｍｓｅｍ￣ｔ　ｍｌｎ＇ａｎｅ　ａｕｔｏ￣ａｌａ＇ｂｏｄｌｅｓ　ｉｎ　Ｃｈｉｎｅ￣ｌｍｔｌ￣ｌｓ　ｗｉｔｈ　ｒａｐｉｄ￣，ｐＩ理　％ｌ　ｇｔｏｎｍｍｔｏｒ￣ｒｌｔｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｒｅｌｅｖａｎｃｅ　ＬｉｕＮ，２，ＺｈａｏＭｉｎｇｈｕ￣，　ｎ增Ｙｏｕｋａｎｇ，ｅｔ　ａ１．Ｉｍｔ￣ｕｔｅｏ，他　ｎ幽　，Ｔｈｅ　ｒ＇ＳｔＨｏｓｐｌｔｏ．ｔｏ，　ＢｅＯｉｎｇＭｅｄｉｃａｌ【　Ｅ）ｒ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００３４　０ｈｉｅｃｔｌ靶Ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｐｒｅｖｌｄｅｔｌｏ￣ｏｆ　ａｕｔｑ：ｍｎｔｉｂｏ：ｌｌｅｓ￣ａｔｎｓｔ　０ｍ朗１ｌａｒ　ｂ自３ｅｒｌ１蚰ｔ　ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｃ　Ｍ）ｉ１３．ｓ喇ｌ　ｏｆ　Ｃｈｈ描ｅ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｒａｎｄｙ　ｐｎ　ｍ∞Ｉｌｏｎ印　血（ＲＰ（　）ａｎｄ　ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅｉｒ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｒｅｌｅｖａｒ￣．Ｍ毗·０凼　Ｓｅｒｕｍ　ａｎｔｉ．ＧＢＭ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉⅡ２９　ＲＰＧＮ　ｐａｔｌｅ￣ｌｔｓ　ｂｙ　ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｍａｏａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）ｕｓｉｎｇ　ｃｏｌｈｇｅｎ，ｘ￣　ｓｏｌｕｂ］／ｚｅｄｈａｍａｎＧＢＭ　ａｓ　ｓｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅｌ　ｎｄ．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｅ￣－ａｗｅＴｅ　ａｌｓｏ￣ｍｆｉｒｍｅｄ　ｂｙＷ荡ｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｃｓｕｌｂ　Ｏｆｔｈｅ　２９　ＲＰ（　ｑ　ｐａｔｉｅｎｔｓ，５（１７％）ｗ　ｌｘ￣ｓｉｔｉｖｅ　ｆｏｒ　ａｎｄ－ＧＢＭ　ａｕｔ￣ｔｉｂｏｄｌｅｓ．Ｏｎｅ　ｉｘ￣ｉｔｌｖｅ［ｏｒ　ｂｏｔｈ　ａｎｔｉ－ＧＢＭ　ａｕｔＣ￣ｔｉｂｏｄｙ　ａｎｄ　Ａｆ　Ｏｎ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ．２３　０００～２７　０００　ａｎｄ柏０００～５４　０００　ｐｏｌ￣ｐｔｉｄｅｓ　】ｌｄ　ｂｅ　ｂｌｏｔｔｅｄ　Ｏｎ　ｄｉｒｅｃｔ　ｉｒｍｕｕｎｏｆｌｔ￣ｅｎｃｅｔｈｅｒｅｗ盯ｅ肿曲１日ｒ　ｃｌｅ￣ｓｌｔｓ　ｏｆ￣ｐｌｅｘｉｎ　ｃａｐｉｌｌａｒｙｌｏｏｐ￣ｉｎｔｈｒｅｅ　ｏｆｆｏｕｒ．Ｃｏ￣￣ｌｍｌｏｍ　１　ｅ　：１　ｋ眦ｅｏｆ　ａｎｔｉ．ＧＢＭ￣ａｔｉｌｘ：ｄｙｍｅｄｉａｔｅｄ　ＲＰＧＮｉｓ　ｎｏｔ　ｒａｌｍｉⅡｃＩ１ｉｎａ．Ｕ　雌ＥＬＩＳＡｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｃ￣＇ｃｕｌａｔｉｎｇ　ａｎｔｉ＿ＧＢＭ　ａｕｔｃ￣ｔｉｈ（ｘｌｉｅｓ　ｈａｄ　ｂｅｅｎ　ｐｒｏｖｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ａⅡｔ辨ｓｌ￣：ｆｉｃ　ａｎｄ　ｓｅｔａｓｉｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｉｔ　ｉｓ　ｉｍｌｘ￣＇ｔａａｔ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｄ蜘ｌａｔｉｎｇ　ａｎｔｂＧＢＭ　ａｕｔｃ￣ｔｉｈｃｘｉｉｅｓ　ｍｒｌｙ　ｈ　ｐａｒｌｅｙ＇ｉｔｓ　ｗｉｔｈ　ＲＰＧＮ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ鞠　ｔｉｍｅ　ｆｏｒ　ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ　ｔｈｅｒａｐｙ．　Ｉ畸ｗｏｒｄｓ　Ｒａｐ诎ｙ　ｐ１１）ｇ瞪ｓｉｖｅ　ｇｌｏｍｅｎｇｏｎｅｐｈｒｉｆｉｓ　ＧＩ叩ｌｅｎｌｌａｒ　ｂａｓｅｍｅｎｔ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ａｕｔｏｍｔｉｂｃｄｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｋｔｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　急进性肾炎（ＲＰＧＮ）又名新月体肾炎，依　赖临床特征可分为原发性及继发性，依赖免疫　学机理可分为Ｉ、Ⅱ、Ⅲ型，即抗肾小球基底膜　（ＧＢＭ）抗体型、免疫复合物型和非免疫介导　（或微量免疫复合物）型，这种传统的分型不仅　对于探讨发病机理，并且对于指导治疗、判断预　后具有重要价值。国外报道抗（　Ｍ抗体在　ＲＰＧＮ中阳性率为１１％～２Ｏ％【１，２Ｊ而国内报道　的仅为５％～１０％左右Ｌ３＿４Ｊ，这种显著差别一直　是国内肾脏病学界所关注的问题，产生这种差　异的原因是否与种族、环境或检测方法有关，一　作者单位　１０￣３４北京医科大学第一医院肾内科，肾脏病　研究所　直未得到确切的阐明。国外于８０年代末期已　开始普遍应用灵敏度及特异性均较高的酶联免　疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）或放射免疫分析法（ＲＩＡ）检　测抗ＧＢＭ抗体，而国内由于条件所限，目前大　多散单位仍采用灵敏度较低的间接免疫荧光方　法（ＩＩＦ）。我们应甩人ＧＢＭ可溶性抗原，以　ＥｕＳＡ方法对我院近六年来临床病理资料完　整的所有ＲＰＧＮ患者进行血清抗ＧＢＭ抗体的　回顾性研究，对抗ＧＢＭ抗体在ＲＰ（　中的发　生率及其临床意义进行了分析，并对ＥＬＩＳＡ检　测抗ＧＢＭ抗体的方法学作了初步评价。

　维普资讯 http://www.cqvip.com 材料和方法　病例选择均来自１９９１年１月～１９９６　年１０月我院肾内科接受肾活检的住院患者，为　具有完整的临床、病理资料的肾小球疾病患者。　于肾穿当日晨取血，留取血清，保存于一５Ｏ℃。　所有肾活检标本均常规经光镜（ＨＥ、ＰＡＳ、　ＰＡＳＭ、Ｍ￣ｓｏｎ染色）、电镜和免疫荧光检查。　ＲＰ（　组２９例，均符合１９９３年黄山会议制定　的诊断标准。ＲＰＧＮ患者肾活检标本均超过　１０个以上肾小球，达到病理学诊断的要求。　对照组选用５８例正常献血员血清和１２０　倒同期经肾活检证实的非新月体性肾小球疾病　患者的血清。其中ＩｇＡ肾病２０例，系膜增殖性　肾炎１５例，微小病变２０例，膜性肾病２Ｏ例．膜　增殖性肾炎５例，狼疮性肾炎２Ｏ例，过敏性紫　嵌肾炎２０倒。　二、可溶性ＧＢＭ抗原的制备　根据　Ｂｏｗｍａｎ的方法ｌ　。主要步骤简介如下：收集　正常肾皮质组织，一２０℃保存。将组织在冰水　中融化并切碎、研磨，筛取肾小球，溶于ｌｍｏｌ／－Ｌ　ＮａＣＩ进行超声粉碎，再以１２１ｇ，４℃离心１５分　钟，去上清，沉淀冷冻干燥，加入胶原酶Ｉ　（Ｓｉｇｍａ），３７℃搅伴２０小时后６０℃１０分钟灭　活胶原酶．７００ｇ离心１５分钟，留取上清，测　２８Ｏｍｎ吸光度值。　三、应用ＥＬＩＳＡ方法检测抗ＧＢＭ抗体　将可溶性ＧＢＭ抗原１／ｚｇ／ｍｌ用０．０５ｍｏ［／－Ｌ碳　酸盐缓冲液（ｐＨ＝９．６）包被一半酶标板　（ＮＵＮＣ公司产品），另一半酶标板则直接用碳　酸缓冲液包被。３７℃孵育１小时后４℃过夜。　加入１：５０稀释的被检或正常血清，３７℃１小　时，然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人　ＩｇＧ，３７℃孵育１小时，加底物缓冲液（０。１　ｍｏ［／－Ｌ枸橼酸缓冲液；ｐＨ５．Ｏ）室温１Ｏ分钟后　以ｌｍｏｌ／－Ｌ　Ｈａ终止反应，再酶标仪读４９０ｎｎｌ　吸光度值（Ａ），各步骤之间用ＰＢＳ洗板三遍，　每孔加样量均为１００　。每块酶标板均设立空　白及阴性、阳性对照，每份血清均设立双抗原包　被孔及双非抗原包被孔。用抗原包被孔平均　Ａ值．非抗原包被孔平均Ａ值作为该血清平均　Ａ值以除外非特异性结合造成的假阳性。以阳　性对照孔Ａ值设为１００％，阴性对照孔设为　１Ｏ％，建立线性回归曲线，算出待检血清结合百　分率。正常值取自５８份正常血清的ｚ十　。　四、应用免疫印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａ［ｙ￣ｓ）鉴定抗ＧＢＭ抗体　１００￣ｇ可溶性　ＧＢＭ抗原在非还原条件下进行十二烷基磺酸　钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ），浓缩胶　浓度４％，分离胶浓度１２％，电泳结束后以　踟Ｖ、１小时将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素　膜（ＮＣ膜）上，电转后，以２％脱脂奶粉封闭ＮＣ　膜，切成０．３ｃｍ的条带，１－－１０号条带分　４加入　空白对照及１：５０稀释的阴性血清，５份ＥＬＩＳＡ　法抗ＧＢＭ抗体阳性血清、１份ＰＲ３．ＡＮＣＡ阳　性标准血清（来自韦格纳氏肉芽肿患者）、１份　ＭＰＯ－ＡＮＣＡ阳性标准血清（来自显微镜下多　血管炎患者）及抗ＧＢＭ抗体标准阳性对照血　清（由剑桥大学医学系Ｐｒｏｆ．Ｃ．Ｍ．Ｌｏｃｋｗｏｏｄ　惠赠）室温孵育过夜，以１：３　０００稀释的碱性磷　酸酶标记的羊抗入ＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｅｈ公司产品）室温孵育１小时，加　底物显色，自来水冲洗终止反应。　结　果　抗ＧＢＭ抗体的检测应用ＥＬＩＳＡ方　法，在５８例正常人及１２０例非新月体性肾小球　疾病患者中，无一例抗ＧＢＭ抗体阳性。在２９　例ＲＰＧＮ患者中，５例抗ＧＢＭ抗体阳性，占　１７％，见附表。其中原发性ＲＰＧＮ　４例，　Ｃ，ｏ￣ｐａｓｔｕｒｅ综合征１例。有３例患者于肾穿　时曾行抗ＧＢＭ抗体ＩＩＦ方法检测，一例阳性．　例为可疑阳性，一例阴性。经免疫印迹法检　测，这５份抗ＧＢＭ抗体阳性血清均识别　４０　０００～５４　０００、２３　Ｏ００～２７　０００的蛋白条带，　与抗ＧＢＭ抗体阳性标准血清识别的条带相一　致。

　维普资讯 http://www.cqvip.com Ｏｃｔｏｂｅｒ　１９９８，Ｖｏ１．１４　Ｎｏ．５　附表５例抗ＧＢＭ抗体用性患者临床及病理资料　

检查；０Ｄ　细胞耕月体；ＣＦＣＧ：细胞纤维新月体；＊电镜下可见（；Ｂ　断裂　二、抗ＧＢＭ抗体阳性患者临床、病理特点　５例抗ＧＢＭ抗体阳性的ＲｐＧＮ患者中男性　４例，女性１例，男性发病平均年龄２１岁（１７～　３２岁），１例女性患者，年龄５２岁。病程１５～　５０天，发病前１例有汽油接触史，３例有前驱感　染症状，全部５例患者均有内眼或镜下血尿、不　同程度蛋白尿和中重度贪血，２例患者有轻中　度高血压。全身系统症状较少。该５例患者均　进行ＡＮＣＡ检测，其中１例女性患者合并　ＰｕＮＣＡ阳性。肾活检病理结果显示，３例为细　胞性新月体为主，２例为细胞纤维性新月体为　主，见附表。４例曾行免疫荧光检查，只有１例　患者见到典型的ＩｇＧ沿ＧＢＭ线样沉积，另３　例为细颗粒样沿ＧＢＭ分布为主。电镜检查，　大部分均伴有ＧＢＭ断裂。就诊时，已有４例　患者出现少尿或无尿、血肌酐达尿毒症水平。　全部患者均于肾穿刺一周内开始进行强化甲基　强的松龙及环磷酰胺冲击治疗，仅有１倒不伴　有少尿及血肌酐来达尿毒症水平的患者脱离透　析，其余４例均依赖透析，见附表。　讨　论　抗ＧＢＭ抗体的检测方法　尽管国外　报道ＥＬＩＳＡ或ＲＩＡ方法检甜血清抗ＧＢＭ抗　体有高度灵敏性及特异性，但该方法在国内尚　未普及　我们制备了ＧＢＭ可溶性抗原，并应　用ＥＬＩＳＡ方法对ＲＰＧＮ患者进行了血清抗　ＧＢＭ抗体的检测，显示了以下的特点。　１．用ＥＵｓＡ方法检测抗ＧＢＭ抗体方法可　靠。在１２０例非新月体肾炎中无一例抗ＧＢＭ　抗体阳性，在２９例ＲＰＧＮ中５例抗ＧＢＭ抗体　阳性，这５例患者临床上病情进展迅速，治疗效　果不佳，预后较差，符合抗ＧＢＭ抗体型ＲＰＧＮ　的临床特点，免疫印迹法也进一步鉴定和验证　全部５份血清均识别４０１３００～５４　０１３０、２３　ｏ００～　２７　１３００的蛋白条带，与国外的报道相一致㈦６。　我们首次在国内采用自行研制的可溶性人　ＧＢＭ抗原，用ＥｕＳＡ方法检验抗ＧＢＭ抗体，　并通过免疫印迹法证实其方法的可靠性。　２．ＥＬＩＳＡ方法较ＩＩＦ法检测抗Ｇ劭　抗体　方法简便、结果稳定。用ＩＩＦ方法检测抗ＧＢＭ　抗体由于受正常肾组织来源、低温保存时间长　短、复温方法及判定结果时主观因素等的髟响．　灵敏度较低，据国外报道仅为４０％左右【　。本　研究中曾有３例抗ＧＢＭ抗体阳性患者进行　ＩＩＦ检测，１例阳性，１例可疑阳性。本研究结　果显示ＥＬｌＳＡ较ＩＩＦ检测抗ＧＢＭ抗体更简　便、灵敏、稳定和客观。　抗ＧＢＭ抗体检测的临床、病理意义　１．本研究结果表明，在全部２９例原发性和　继发性ＲＰＧＮ患者中５例抗ＧＢＭ抗体阳性，　占１７％，说明抗ＧＢＭ抗体型ＲＰＧＮ在中国并　不少见，发生率与国外报道相似。　２．本文５例患者中，肾活检电镜结果显示　大部分伴有ＧＢＭ的断裂，４例曾行直接免疫荧　光检查，仅有ｔ铡呈典型的ＩｇＤ沿ＧＢＭ线样　沉积，其余３例表现为沿ＧＢＭ｛田颗粒样沉积。　国外研究显示在抗ＧＢＭ抗体肾炎中，约３５％　以上病例直接免疫荧光可表现为免疫复合物　型，特别在病程中后期，其原因不清，可能与抗　ＧＢＭ抗体与ＧＢＭ舶结合形成新的抗原，从而　导致机体第二抗体的产生，故而使早期的沿　ＧＢＭ线样分布，在中、后期可变为细小颗粒样　免疫复合物沿ＧＢＭ沉积Ｌ８　Ｊ

。因此，不应仅局　维普资讯 http://www.cqvip.com