1 实验一 罗非鱼在冰藏中鲜度变化的检测
陈曼韵 11食品营养3班 201130600802
摘要 鱼的新鲜度与其所含的盐溶性蛋白质含量有关，蛋白质的功能特性主要是由肌原纤维蛋白决定的，测定盐溶性蛋白质在一定程度上能反应出现蛋白质的变性情况。挥发性盐基氮值作为鱼类新鲜度的指标之一，是以鱼类鲜度因细菌作用而降低这一概念为基础的。三甲胺是判断鱼类鲜度的化学指标之一，也是鱼腥臭的主要来源，它是氧化三甲胺的还原产物。
关键词：罗非鱼 鲜度 感官评定 盐溶性蛋白质 微量扩散法 挥发性盐基氮 三甲胺
罗非鱼具有适应性强、繁殖率高及肉味鲜美等特点, 为世界重要的养殖鱼类。自引进我国后经过多年的养殖繁育和发展, 现在已成为我国重要的淡水养殖对象, 在全国各地广泛养殖。
鲜度对水产品的品质及原料的加工有着巨大的影响,在收购、运销、加工过程中常常需要水产品对鲜度质量进行鉴别。目前,评定水产品鲜度方法可概括感官的、化学的(如K 值、三甲胺、挥发性盐基氮、氨基态氮、挥发性盐基氮/ 三甲胺比值) 、物理的(僵硬指数、激光) 、微生物学及上述方法之间的组合评价等[1]。蛋白质的功能特性主要由肌原纤维蛋白决定，蛋白质变性后肌原纤维蛋白的溶解度降低，盐溶性蛋白含量减少[2]。测定盐溶性蛋白在一定程度上反映了蛋白质的变性情况 [ 3]。三甲胺是判断海水鱼类鲜度的化学指标之一, 也是鱼腥臭的主要来源, 早在30年代Boury等人就提出三甲胺值可以作为鱼类的鲜度指标,
此后, 大多数学者都肯定了这种指标的实用性[ 4 ] 。
本文主要通过感官评定，盐溶性蛋白、挥发性盐基氮和三甲胺含量的检测，研究罗非鱼在冰藏下鲜度的变化，并分析导致变化的因素，这对于研究淡水鱼在冷藏情况下保持鱼鲜度有重要的意义。
一、实验目的
1、掌握鱼体在冰藏中鲜度变化的感官检测方法；
2、掌握鱼体在冰藏中鲜度变化的化学检测方法，包括挥发性盐基氮、三甲胺及盐溶性蛋白的测定原理和方法。 2 二、实验内容
2.1鱼新鲜度的感官鉴别
冰鲜鱼类鲜度的感官鉴别指标如表1所示。
表1. 冰鲜鱼类鲜度的感官鉴别指标
项目 新鲜 较新鲜 不新鲜
眼球 眼球饱满，角膜透明清亮，有弹性 眼角膜起褶，稍变浑浊，有时由于内溢血发红 眼球塌陷，角膜浑浊，虹膜合眼腔被血红色素浸红
鳃部 鳃色鲜红，粘液透明，无异味，（淡水鱼可带土腥味） 腮色变暗呈淡红、深红或紫红，粘液带有发酸气味或稍有腥味 腮色呈褐色，灰白色有混浊的粘液，带有酸臭，腥臭或陈腐味
肌肉 坚实有弹性，手指压后凹陷立即消失，无异味，肌肉切面有光泽 稍松软，手指压后凹陷不能立即消失，稍有腥酸味，肌肉切面无光泽 松软，手指压后凹陷不易消失，有霉味和酸臭味，肌肉易与骨骼分离
体表 有透明粘液，鳞片有光泽，贴附鱼体紧密，不易脱落（鲳、大黄鱼、小黄鱼除外） 粘液多不透明，并有酸味，鳞片光泽较差易于脱落 鳞片暗淡无光泽，易于脱落，表面粘液污秽，并有腐败味
腹部 正常不膨胀，肛门凹陷 膨胀不明显，肛门稍突出 膨胀或变软，表面发暗色或淡绿色斑点，肛门突出
根据上表鱼体鲜度变化的指标，记录冰藏了一段时间的罗非鱼的鲜度变化，并与新鲜鱼对比。
2.2盐溶性蛋白的测定
（一）实验原理
鱼肉中的蛋白质按照是否溶于水以及高离子浓度的盐溶液可以分为两种：盐溶性蛋白和水溶性蛋白。前者如肌球蛋白、肌动蛋白，而水溶性蛋白有肌浆蛋白等。盐溶性蛋白和水溶性蛋白都溶解于高离子强度的盐溶液中，而水溶性蛋白同时又溶解于低离子强度的盐溶液中。因此，高盐溶液中的蛋白质含量减去低盐溶液的蛋白质含量即为盐溶性蛋白质含量。
（二）实验原料与仪器
1、实验原料及试剂
1.1 新鲜罗非鱼及冰藏罗非鱼（约4天） 3 1.2 高离子磷酸缓冲液（0.5M KCl-0.01M NaH2PO4-0.03M Na2HPO4）
1.3 低离子磷酸缓冲液(0.025M NaH2PO4-0.025M Na2HPO4)
1.4 15%三氯醋酸（TCA）
1.5 1N NaOH
1.6 双缩脲试剂：混合1.50gCuSO4.5H2O和6.00g酒石酸钾钠，加入500ml蒸馏水，置于烧杯中搅拌，搅拌时加入300ml10%NaOH，转移入1升的容量瓶，定容至1升，转移入塑料瓶保存。
2、实验仪器
天平（1台）、100ml烧杯（8个）、研钵（2个）、高速离心机（共2台），离心管（50ml，每组8根），100ml容量瓶（2个）、25ml容量瓶（4个）、752紫外分光光度计（共2台），移液管（1ml、2ml、5ml各2根），100ml量筒（1个）、滤纸（2包/班）、漏斗（2个），10ml试管（10根）。
（三）操作步骤
1．1 样品处理：称取鱼肉样品两份（每份1g）于研钵中捣碎，转入100ml烧杯中（用高离子磷酸缓冲液和低离子磷酸缓冲液），分别加入30ml高离子磷酸缓冲液和低离子磷酸缓冲液（包括前面加入的溶液量）进行抽提。前者抽提3小时，后者抽提1小时。然后在4000rpm离心10分钟。取上清液，加入5ml 15%三氯醋酸（TCA）使蛋白质沉淀，静置2小时后再以4000rpm离心5分钟。除去上清液取沉淀，用5ml1N NaOH 溶解沉淀，再分别以高\低盐磷酸缓冲液定容至25ml，用蒸馏水设置空白对照，然后用双缩脲法测定蛋白质含量*。
1．2 测定：取1毫升蛋白质溶液，加入4毫升双缩脲试剂，放置半小时后测定光密度（波长 540nm）。在标准曲线上查出蛋白质含量。
1．3计算：
盐溶性蛋白含量(mg/g)=A-B
(蛋白质浓度标准曲线采用Y=0.0584X+0.06)
(Y高-0.06)
A= 25ml 样品重
0.0584 4
(Y低-0.06)
B= 25ml 样品重
0.0584
Y-----测得的吸光度（Y高、Y低分别为高盐和低盐溶液中的吸光度）；
X----蛋白质浓度，mg/ml；
A----高盐溶液中蛋白质含量，mg/g鱼肉；
B----低盐溶液中蛋白质含量，mg/g鱼肉；
2.3挥发性盐基氮（VBN）的测定（微量扩散法）
挥发性盐基氮包括氨和低级胺类。这些胺类和氨的沸点低，具有挥发性，均呈碱性，称为挥发性盐基氮，一般用VBN或TVB-N(Total Volatile Basic Nitregen)表示，单位为mg/100g。
（一）实验原理
挥发性盐基氮包括氨和低级胺类，其沸点都很低，都有挥发性，在碱性溶液蒸出后，用硼酸吸收，用硫酸或盐酸滴定定量。
反应式如下：
2NH3+4H3BO3 → (NH4)B4O7+5H2O
(NH4)2B4O7+HCl+5H2O → 2NH4Cl+4H3BO3
(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O → (NH4)2SO4+4H3BO3
（二）实验原料及仪器
1、实验原料及试剂：
1.1 新鲜罗非鱼及冰藏罗非鱼（约4天）
1.2试剂：
①0.01N硫酸标准溶液或盐酸标准溶液。
②0.2%甲基红指示剂（60%乙醇溶液）。
③0.1%次甲基蓝指示剂（水溶液）。
④20%三氯醋酸溶液。
⑤40%碳酸钾溶液（碱式）。 5 ⑥2%硼酸溶液。
⑦硼酸吸收剂。取2%硼酸溶液100毫升，加0.5毫升0.2%甲基红指示剂和0.5毫升0.1%次甲基蓝指示剂。用时现配。
⑧水溶胶。称取阿拉伯胶10克于玻璃研钵中，加水15毫升、甘油5毫升、无水碳酸钾5克，边加边研匀，倒入分液漏斗中，放置过夜，分出下层无泡胶，注入平皿的包有纱布脱脂棉垫上。加盖保存备用（也可用凡士林来代替）
2、实验仪器
①康威皿（4个，附磨砂厚玻璃盖）。内外室总直径100毫米。内室直径44毫米，深度15毫米，壁厚3毫米。外室直径20毫米，深度20毫米，壁厚5毫米。
②微量滴定管：最小分度为0.01毫升。
③研钵、烧杯等同上。
（三）操作步骤
1.1样品处理 称取罗非鱼背脊肉10g，放入研钵中捣匀，用少量蒸馏水将其转入100ml容量瓶中，加入20ml20%三氯醋酸，加水至刻度使成10%的浸出液，混匀，静止30分钟，待蛋白质沉淀后，用干燥滤纸滤入干燥的烧杯中，滤液备测。在康威皿外室磨口上涂以水溶胶（或凡士林），内室加入2%硼酸吸收剂2毫升，再于外室的一边准确加入2ml样品浸出液，盖上玻璃盖（缺口处不盖紧），然后通过玻璃盖上的缺口在外室的另一侧加入2ml40%碳酸钾溶液，立即盖紧玻璃盖，轻轻转动，使外室液体混匀。置于37恒温箱内保温2小时，取出，冷至室温，用0.01N硫酸或盐酸标准溶液滴定内室的硼酸吸收剂，使至蓝紫色即为终点。同时做一空白试验。
1.2计算：
(V1-V2)×N×14×100
挥发性盐基氮（VBN）（毫克/100克样品）=
W
式中：
V1：滴定样品消耗标准酸溶液体积（ml）。
V2：滴定空白消耗标准酸溶液体积（ml）。
W：用于滴定时样品液所含样品重量（克）。 6 N：标准酸溶液规定浓度。
14：每克当量氮的克数。
2.4 三甲胺（TMA-N）的测定（微量扩散法）
（一）实验原理
氨和甲醛反应化合成六次甲基四胺，而三甲胺和甲醛不起作用，在碳酸钾（或氢氧化钾）碱性溶液中，三甲胺即挥发，将其吸收于带指示剂的硼酸溶液中，用标准酸溶液滴定即可计算出三甲胺的含量。
（二）实验原料与仪器
1、实验原料及试剂
1.1 新鲜罗非鱼及冰藏罗非鱼（约4天）
1.2试剂
①0.01N硫酸标准溶液或盐酸标准溶液。
②0.2%甲基红指示剂（60%乙醇溶液）。
③0.1%次甲基蓝指示剂（水溶液）。
④20%三氯醋酸溶液。
⑤40%碳酸钾溶液。
⑥2%硼酸溶液。
⑦硼酸吸收剂：取2%硼酸溶液100毫升，加0.5毫升0.2%甲基红指示剂和0.5毫升0.1%次甲基蓝指示剂。用时现配。
⑧水溶胶。称取阿拉伯胶10克于玻璃研钵中，加水15毫升、甘油5毫升、无水碳酸钾5克，边加边研匀，倒入分液漏斗中，放置过夜，分出下层无泡胶，注入平皿的包有纱布脱脂棉垫上。加盖保存备用（也可用凡士林来代替）
⑨甲醛溶液：取40%甲醛溶液，加入碳酸镁粉末，振摇后过滤。
2、仪器： 同上
（三）操作步骤
样品提取液制备同挥发性盐基氮的样品制备。吸取样品提取液2毫升于康威皿外室，加入0.5毫升的甲醛溶液，皿的内室加0.5毫升2%硼酸吸收液，混匀样品提取液和甲醛溶液，皿口涂上水溶胶（或凡士林），在皿外室加入1毫升40%