蛋白质组学相关技术及发展文献综述 张粒 植物学 21107016 1 概念及相关内容

1994年澳大利亚Macquaie大学的Wilkins和Williams等在意大利的一次科学会议上首次提出了蛋白质组(proteome)这个概念，该英文词汇由蛋白质的“prote”和基因组的“ome”拼接而成，并且最初定义为“一个基因组所表达的蛋白质”[1]。然而这个定义并没有考虑到蛋白质组是动态的，而且产生蛋白的细胞、组织或生物体容易受它们所处环境的影响。目前认为蛋白质组是一个已知的细胞在某一特定时刻的包括所有亚型和修饰的全部蛋白质[2]。蛋白质组学就是从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，提示蛋白质的功能与细胞的活动规律。 2 蛋白质组学的分类 蛋白质组学从其研究目标方面可分为表达蛋白质组学和结构蛋白质组学。前者主要研 究细胞或组织在不同条件或状态下蛋白质的表达和功能，这将有助于识别各种特异蛋白[3]，目前蛋白质组学的研究在这方面开展的最为广泛,其运用技术主要是双相凝胶电泳（Two-dimensional gel electrophoresis，2DE）技术以及图像分析系统, 当对感兴趣的蛋白质进行分析时可能用到质谱。由于蛋白质发生修饰后其电泳特性将发生改变，这些技术可以直接测定蛋白质的含量，并有助于发现蛋白质翻译后的修饰，如糖基化和磷酸化等[4] 。 结构蛋白质组学的目标是识别蛋白质的结构并研究蛋白质间的相互作用。近年来，酵母双杂交系统是研究蛋白质相互作用时常用的方法，同时研究者也将此方法不断改进[5]。有研究者最近发现在研究蛋白质相互作用时通过纯化蛋白复合物并用质谱进行识别是很有价值的[4]。 3 蛋白质组学相关技术 目前蛋白质组学研究在表达蛋白质组学方面的研究最为广泛，其分析通常有三个步骤：第一步，运用蛋白质分离技术分离样品中的蛋白质；第二步，应用质谱技术或N末端测序鉴定分离到的蛋白质；第三步，应用生物信息学技术存储、处理、比较获得的数据。 3.1 蛋白质分离技术 这类技术主要是电泳，其中应用最多的是双向电泳技术，其他还有SDS-PAGE、毛细吸管电泳等。除了电泳外还有液相色谱，通常使用高效液相色谱(HPLC)和二维液相色谱(2D-LC)。 另外还有用于蛋白纯化、除杂的层析技术、超离技术等。 3.1.1双相凝胶电泳 双相凝胶电泳（two-dimensional gel elec—trophoresis，2DE)这是最经典、最成熟的蛋白质组分离技术，产生于20世纪70年代中叶，但主要的技术进步(如实验的重复性、可操作性，蛋白质的溶解性、特异性等)是在近lO年取得的。它根据蛋白质不同的特点分两相分离蛋白质。第一相是等电聚焦(IEF)电泳，根据蛋白质等电点的不同进行分离。蛋白质是两性分子，根据其周围环境pH可以带正电荷、负电荷或静电荷为零。等电点（pI）是蛋白质所带静电荷为零时的pH，周围pH小于其pI时，蛋白质带正电荷，大于其pI时蛋白质带负电荷。IEF时，蛋白质处于一个pH梯度中，在电场的作用下，蛋白质将移向其静电荷为零的点，静电荷为正的蛋白将移向负极，静电荷为负的将移向正极，直到到达其等电点，如果蛋白质在其等电点附近扩散，那么它将带上电荷重新移回等电点。这就是IEF的聚焦效应，它可以在等电点附近浓集蛋白，从而分离电荷差别极微的蛋白。 pH梯度的形成最初是在一个细的包含两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶管中进行。在电流的作用下，两性电解质可形成一个pH梯度。但由于两性电解质形成的pH梯度不稳定、易漂移、重复性差，80年代以后，研究人员研制了固定pH梯度的胶条（IPG）。此种胶条的形成需要一些能与丙烯酰胺单体结合的分子，每个含有一种酸性或碱性缓冲基团。制作时，将一种含有不同酸性基团的此分子溶液和一种含有不同碱性基团的此分子溶液混合，两种溶液中均含有丙烯酰胺单体和催化剂，不同分子的浓度决定pH的范围。聚合时丙烯酰胺成分与双丙烯酰胺聚合形成聚丙烯酰胺凝胶。 第二相是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，根据蛋白质的分子量不同进行分离。此相是在包含SDS的聚丙烯酰胺凝胶中进行。SDS是一种阴离子去污剂，它能缠绕在多肽骨架上使蛋白质带负电，所带电荷与蛋白质的分子量成正比，在SDS聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质分子量的对数与它在胶中移动的距离基本成线性关系。SDS-PAGE装置有水平和垂直两种形式，垂直装置可同时跑多块胶，如Amersham pharmacia Biotech的Ettan DALT II 系统可同时跑12块胶，提高了操作的平行性。 经过2DE以后，二维平面上每一个点一般代表了一种蛋白，这样成千种不同的蛋白即可被分离，有关蛋白质的等电点、分子量及每种蛋白的数量信息也可以得到。 蛋白质组学分析对2DE后的染色技术要求很高，除了标准的敏感性要求外，还要求染色技术的线性和均一性[6]。目前有多种染色方法，如考马斯亮蓝染色、银染色、及荧光染色等。银染比考马斯亮蓝染色灵敏度高，已有学者对这两种方法进行了比较，如PhillipCash等在 检测肺炎链球菌红霉素敏感株和抵抗株表达的蛋白时，用考马斯亮蓝G-250染色，发现了200多种蛋白，PI 4-7，分子量15000-110000，在相同的PI和分子量范围下用银染检测到360多种蛋白[7]。但是银染的线性效果并不是很好，并且对质谱分析干扰大。考马斯亮蓝染色线性、均一性较高, 对质谱干扰较小, 但其敏感性较低。较理想的是荧光染色，Thierrry Rabilloud等比较了两种荧光剂RuBps和Sypro Ruby的效果，发现其敏感性、线性都很好，对质谱干扰小[6]，但其成本较高。实验时，可以根据不同的目的选用不同的方法。 2DE图像所产生的大量蛋白质点是单纯用肉眼分析无法完成。目前有多种图像分析软件可用于胶的图像分析，如MelanieII (BioRad), PD Quest (BioRad), Phoretix 2D Full,又称2D Image Master Elite (Amersham Pharmacia Biotech) 等，这些软件可以完成蛋白质点的识别、匹配等，具有很强的分析功能，但其缺点是需要很多的图像手工校对，一般分析一个图像需要8-10h。 2DE是目前唯一的一种能溶解大量蛋白质并进行定量的方法，具有高通量、重复性好、敏感性较高等优点[8]。它能同时分离和定量数千种甚至上万种蛋白[8]。它的分辨率极高，等电聚焦相可以区分PI相差0.1的蛋白质，SDS-PAGE相可以区分分子量相差1kD的蛋白质[9]。 其缺点是由于蛋白表达水平的差异较大，一些低丰度的蛋白不易检测[8,10]。另外某些基因的表达产物在2D胶中呈多点或不同基因的表达产物共点，使2D胶数据的比较、定量更加复杂[8]。2DE分离的蛋白数量受诸多因素影响，疏水性的膜蛋白（往往是药物设计最好的靶点）很难用此法分离，同时染色技术的灵敏度和线性范围不足以呈现所有分离的蛋白质。目前，人们采用多种方法来减少这些缺点，如通过增加上样量分离低丰度蛋白，应用窄范围固定pH梯度胶条、蛋白层析等技术提高分离的蛋白数目，应用荧光染色提高检测灵敏度等。 3.1.2双向荧光差异电泳 双向荧光差异电泳(two—dimensional difference gel electrophoresis，2D—DlGE) 2D—DIGE分析系统是在传统双向电泳技术的基础上，结合了多重荧光分析的方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品，并第一次引入了内标的概念，极大地提高了结果的准确性、可靠性和重复性。在DIGE技术中，每个蛋白点都有它自己的内标，且软件自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，这样可以很好地去除样品的假阳性差异点。DIGE技术可检测到表达差异小于10％的蛋白，统计学可信度达到95％以上。利用Ettan DIGE技术还可以对微量(少到5μg)样品进行蛋白质组学分析。2D-DIGE的具体操作过程与常规2DE的步骤相似，所不同的就是在样品制备时，在每份样品中预先分别加入不同的荧光染料，并且需要制作一个供其他样品比较的内参，另外在电泳后的凝胶显色时需要在特殊的荧光检测 仪中进行。 3.1.3液相色谱 高效液相色谱因具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高和应用范围广等特点，广泛应用于生产实践中。高效液相色谱是利用高压输液泵驱使带有样品的流动相通过装填固定相的色谱柱，利用固液相之间的分配机理对混合物样品溶液进行分离的方法。例如对奶粉中三聚氰胺的检测[11]。二维或多维液相色谱，是将分离机理不同而又相互独立的两支色谱柱串联起来构成的分离系统。样品经过第一维的色谱柱进入接口中，通过浓缩、捕集或切割后被切换进入第二维色谱柱及检测器。二维液相色谱通常采用两种不同的分离机理分析样品，即利用样品的不同特性把复杂混合物(如肽)分成单一组分，这些特性包括分子尺寸、等电点、亲水性、电荷、特殊分子间作用(亲和)等。在一维分离系统中不能完全分离的组分，可能在二维系统中得到更好的分离，分离能力、分辨率得到极大的提高。完全正交的二维液相色谱，峰容量是两种一维分离模式单独运行时峰容量的乘积。 3.2目的蛋白点的筛选 对目的蛋白的筛选通常与双向电泳连用，主要用来分析凝胶中分离出的蛋白质样品，采用的主要技术手段通常是Western印迹和差异蛋白比较分析。Western印迹主要是将双向电泳后的凝胶不经过染色而直接转印到固相支持物(如NC膜、PVDF膜等)上，再在膜上进行免疫学反应，从而筛选出与免疫功能相关的蛋白；差异蛋白比较分析则是先对凝胶进行染色，然后应用软件(如Image Master、PDQuest等)对存在差异的2组凝胶进行比较，从而找出差异的蛋白。在比较时，通常要求每个被分析的样品重复3次，然后先做组内比较，再做组间比较。 3.3蛋白质鉴定技术 对2DE所产生的上千个蛋白用传统的方法如Edman降解法等进行分析将是一个很艰巨的任务。质谱技术的发展解决了这一难题。 3.3.1一级质谱 质谱技术的高速发展，目前可以快速、高效地对目的蛋白进行鉴定，且样品用量少(通常达到微克级)。除此之外，质谱技术还可以对蛋白质翻译后修饰进行分析。根据离子源的不同，质谱主要包括基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDITOFMS)、电喷射离子井飞行时间质谱(ESI—TOFMS)。常用的质谱分析仪除了飞行时间(TOF)外，还有四级杆(Q)、离子井，而在串联质谱中通常使用的是Q—TOF或TOF—TOF等。 2种离子源都可以使肽段、蛋白、药物的代谢产物、寡核苷酸等其他碳水化合物离子化，进而被质谱仪分析。通常的质谱仪一般由样品槽、离子源、分析仪和检测器组成。