酶解法提取黑豆多糖的研究魏俊青，肖春玲，陆 楠，张慧敏，王君翠，张海燕（山西师范大学工程学院，山西临汾 ０４１００４）摘 要：以黑豆为原料，采用不同种类的酶研究了提取黑豆多糖的技术，试验在不同的酶解浓度、温度、时间、ｐＨ值对黑豆多糖提取率的影响的基础上，用星点设计法优化了酶法提取黑豆多糖的最佳工艺参数。
结果表明：在用纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶进行的提取中，纤维素酶法提取率最高；最优的提取参数为酶浓度３ｍｇ／１００ｍｌ、ｐＨ６．０、酶解时间１２０ｍｉｎ、酶解温度５０℃、黑豆多糖得率为０．３２１４％，与理论贴近度９９．４１％，各因素对多糖得率的影响顺序为ｐＨ＞酶解时间＞酶解温度。
关键词：黑豆；多糖；酶解法；星点设计 黑豆在我国种植范围很广，其具有高蛋白，低热量的特性［１］，黑豆还具有软化血管，润皮肤，延缓衰老的作用，特别是对高血压，心脏病，肝脏和动脉等方面的疾病有一定的疗效［２］。
目前对植物中多糖的提取主要采用热水浸提法、碱浸提法、酸浸提法［３］。
热水浸提法因它的溶剂是水，原料中的多糖不容易从细胞中大量溶出；碱浸提法和酸浸提法，因为原料的结构受到了破坏，提取率相对较低。
目前利用酶解法提取多糖仅仅是在香菇、蓝莓、蛤蟆油［４－６］，而采用酶解法对黑豆中多糖的提取尚未见报道。
试验以黑豆作为原料，采用酶解法，利用星点优化设计对黑豆中的多糖提取工艺进行优化，并确定其最佳参数，以期为黑豆酶解多糖的提取工艺提供理论依据。
１ 材料与方法１．１ 试验材料与试剂黑豆购于临汾新银河超市；石油醚、无水乙醇、无水葡萄糖标准品、乙醇（９５％）、浓硫酸、苯酚、柠檬酸、氨水均为分析纯；纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶均购于华科生化试剂商城。
１．２ 主要仪器与设备ｐＨＳ－３ＴＣ精密数显酸度计，上海沪粤明科学仪器有限公司；ＲＪ－ＴＤＬ－４０Ｃ台式低速大容量离心机，上海精科实业有限公司；ＵＶ－１１００型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；Ｆ８０高速粉碎机，金城市金城国胜实验仪器厂。
收稿日期：２０１２－０６－１８ 基金项目：山西师范大学大学生创新性训练项目（ＳＤ２０１２ＣＸＳＹ－０６）；山西师范大学科研课题组（８７３０４１）。
作者简介：魏俊青（１９８８－），女，学士，食品科学。
通信作者：肖春玲（１９６８－），女，教授，硕士，主要从事食品科学教学研究工作櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭櫭。
播种，种植密度为１．２万株／６６７ｍ２）处理组合的油菜产量最高，达２３２．０ｋｇ／６６７ｍ２。
另外，试验结果是在一年试验条件下获得，由于播期试验受年度间气候因素的影响，不同年度最适播期可能有所不同，存在一定的差异，如何更合理地安排播种期、科学施肥，进行标准化栽培，以提高秦优１９在适宜区的商品性和经济收益，有待今后进一步的研究和探索。
参考文献：［１］ Ａｓｔｈａｎａ．Ａ．Ｎ．ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉａｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ａｔ ｔｗｏｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｐｌａｎｔｉｎｇ ｕｎｄｅｒｕｎｉｒｒｉｇａｔｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｌｎｄ．［Ｊ］．Ａｇｒｉｃ Ｓｃｉ，４３（１）：３８－４１．［２］ 梁建芳，和中秀．春油菜青杂２号在湟中县川水地区种植密度试验初报［Ｊ］．甘肃农业科技，２００５，（１０）：１８－２０．［３］ 官春云．甘蓝型油菜产量形成的初步分析［Ｊ］．作物学报，１９８０，６（１）：３５－４４．［４］ 刘后利主编．实用油菜栽培学［Ｍ］．上海：上海科技出版所，１９８７，２２０－２３０，３３０－３４５．［５］ 杨经泽，徐育松．等．油菜密植增角的高产裁培模式［Ｊ］．中国油料，１９９３，（２）：４９－５２．［６］ 袁继超，张垃仲．雅安地区蓉油３号综合高产栽培技术研究［Ｊ］．四川农业大学学报，１９９７，１５（３）：３５－５４．１．３ 试验方法１．３．１ 黑豆粉的制备 选择优质的黑豆浸泡３０ｍｉｎ，在６５℃下烘干后粉碎过４０目筛得到粉末，用石油醚脱脂，常温下干燥保存。
１．３．２ 酶解法提取黑豆多糖的过程 称取１ｇ黑豆粉于１００ｍｌ的容量瓶中，加入５０ｍｌ蒸馏水混匀。
其内加入６ｍｌ的酶溶液于水浴锅中加热反应２ｈ，然后调节到９０℃，历时３０ｍｉｎ，从而促使酶活化；在３ ０００ｒ／ｍｉｎ的条件下离心１０ｍｉｎ，取出上清液，加入９５％的乙醇溶液，静置，充分沉淀。
取出上清液，剩下的液体再次离心１５ｍｉｎ。
用无水乙醇来洗涤沉淀，干燥后得到粗多糖，称其质量。
最后，用蒸馏水来溶解粗多糖，测其吸光度。
１．３．３ 黑豆多糖的测定 多糖含量的测定方法通常采用的是苯酚－硫酸法［７］。
以葡萄糖标准溶液为标品，得标准回归方程：ｙ＝０．０５６８ｘ－０．０１３３（０－１４μｇ／ｍｌ，Ｒ２＝０．９９８３），其中ｙ表示吸光度，ｘ表示葡萄糖浓度。
多糖的得率（％）＝粗提物中含有的多糖质量／最初黑豆粉的质量×１００％。
１．３．４ 单一酶解法提取黑豆多糖试验 因纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶的最适反应条件分别是温度４５－６０℃，ｐＨ ４．０－５．５；４５－５０℃，ｐＨ３．０－６．０；６０℃左右，ｐＨ ４．５－７．０［８］。
因此选择５０℃、ｐＨ５．０为酶解液条件进行试验。
试验分别采用三种酶加入的方法，在相同的条件下进行试验，比较多糖得率。
１．３．５ 黑豆多糖提取工艺优化 在３种酶试验的基础上，选择对黑豆多糖提取率最高的酶进行单因素试验，分别考察ｐＨ、酶解温度、时间、浓度对黑豆多糖提取率的影响。
根据结果，从中选出对多糖得率影响较大的３个因素。
使用星点优化设计软件对此进一步优化，最终确定黑豆多糖的最佳提取参数。
２ 结果及分析２．１ 三种酶的比较在木瓜蛋白酶、纤维素酶、果胶酶三种酶浓度都为３ｍｇ／１００ｍｌ、ｐＨ５．０、温度５０℃、时间２ｈ的相同的条件下，比较多糖得率。
其中木瓜蛋白酶得率为０．１６８８％，纤维素酶为０．１８５４％，果胶酶为０．１３６１％。
结果表明，用纤维素酶提取黑豆多糖得率相对较高。
２．２ 纤维素酶提取的单因素试验２．２．１ 不同ｐＨ对黑豆多糖得率的影响 固定酶浓度３ｍｇ／１００ｍｌ，提取时间２ｈ，提取温度５０℃，考察不同ｐＨ对多糖得率的影响，结果见图１。
图１表明，黑豆多糖的得率是随着ｐＨ的变大在逐渐增大。
而当ｐＨ增加到６．０时，曲线出现峰值，如果持续增加结果反而下降。
因此，选出的最适ｐＨ为６．０。
图１ 不同ｐＨ对黑豆多糖得率的影响２．２．２ 不同酶解温度对黑豆多糖得率的影响 固定酶浓度３ｍｇ／１００ｍｌ，提取时间２ｈ，ｐＨ ６考察不同温度对多糖得率的影响，结果见图２。
图２看出，温度对酶的活性有一定程度的影响，多糖的得率随着温度的升高而逐渐变大，达到５０℃时，多糖的得率最大，而这以后会随着温度的继续升高，多糖的得率反而会降低。
这是因为温度除了影响多糖的浸出速度，还会影响酶的活性的大小。
因此，黑豆多糖的最佳酶解温度为５０℃。
图２ 不同温度对黑豆多糖得率的影响２．２．３ 不同酶解时间对黑豆多糖得率的影响 固定酶浓度３ｍｇ／１００ｍｌ，时间２ｈ，ｐＨ ６，温度５０℃考察不同时间对多糖得率的影响，结果见图３。
图３看出，多糖的得率随着酶解时间的增长呈现出上升的趋势，试验时间为２ｈ的时候，出现了最高点，如果继续增加反应时间，多糖的得率反而会下降。
因此，黑豆多糖的最佳酶解时间为２ｈ。
图３ 不同时间对黑豆多糖得率的影响２．２．４ 不同酶浓度对黑豆多糖得率的影响 固定提取时间２ｈ，ｐＨ ６，温度５０℃，考察不同酶浓度对多糖得率的影响，结果见图４。
图４看出，黑豆多糖的得率会随着酶浓度的增加而逐渐增加，当浓度达到３ｍｇ／１００ｍｌ的时候，多糖的得率为最大，因此黑豆多糖的最佳酶浓度为３ｍｇ／１００ｍｌ。
图４ 不同酶浓度对黑豆多糖的影响２．３ 星点设计优化提取黑豆多糖的工艺参数试验２．３．１ 试验设计 用酶浓度为３ｍｇ／１００ｍｌ，确定ｐＨ（Ｘ１），酶解温度（Ｘ２），酶解时间（Ｘ３）３个变量对多糖得率的影响，因素和水平见表１。
表１ 星点设计因素水平因素编码编码水平－１．６８－１ ０ １ １．６８ｐＨ Ｘ１４．３２ ５．０ ６．０ ７．０ ７．６８酶解温度Ｘ２３３．２ ４０ ５０ ６０ ７６．８酶解时间Ｘ３０．３２ １ ２ ３ ３．６８２．３．２ 星点试验设计结果 由Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘ－ｐｅｒｔ７．１．６软件［９］可知３因子５水平的组合设计为２０个试验方案，试验结果见表２。
表２ 星点试验设计及结果试验序号水平多糖得率（％）Ｘ１Ｘ２Ｘ３试验值预测值１－１．６８ ０ ０ ０．１３３０ ０．０９８２ １．６８ ０ ０ ０．１５０２ ０．３２０３－１ １ １ ０．１３３４ ０．１２０４ １ １－１ ０．０８１５ ０．１３０５ １－１－１ ０．０８２１ ０．１００６ ０ ０ ０ ０．３２１４ ０．１３０７ １ １ １ ０．０９２９ ０．１４０８ ０ ０ ０ ０．３２１４ ０．１３０９ ０ ０ ０ ０．３２１４ ０．１３０１０ ０ １．６８ ０ ０．１２６８ ０．３２０１１ ０－１．６８ ０ ０．２１２４ ０．３２０ 续表２１２－１－１－１ ０．１１３７ ０．１３０１３ ０ ０ ０ ０．３２１４ ０．１３０１４ １－１ １ ０．１００９ ０．１６０１５ ０ ０ ０ ０．３２１４ ０．１３０１６－１－１ １ ０．１０８７ ０．１３０１７ ０ ０ ０ ０．３２１４ ０．１３０１８ ０ ０－１．６８ ０．１７３８ ０．１１０１９ ０ ０ １．６８ ０．１２４５ ０．１２０２０－１ １－１ ０．０９３６ ０．１１０ 根据表２，在α＝０．０５，剔除不显著项后，建立的回归方程为：Ｙ＝０．３２－４．６８１Ｅ－００３Ｘ１－０．０１１Ｘ２－１．３１２Ｅ－００３Ｘ３－１．６５０Ｅ－００３Ｘ１Ｘ２－５．７５０Ｅ－００４Ｘ１Ｘ３－０．０７３Ｘ１２－０．０６３Ｘ２２－０．０７０Ｘ３２其中：Ｙ为多糖得率的预测值；Ｘ１为ｐＨ的编码值；Ｘ２为酶解温度的编码值；Ｘ３为酶解时间的编码值。
表３ 回归模型方差分析变异来源平方和自由度均方Ｆ值Ｐ值显著性模型０．１７ ９ ０．０１９ １７．６６＜０．０００１＊＊Ｘ１２．９１３Ｅ－００４ １ ２．９１３Ｅ－００４ ０．２７ ０．００５７＊＊Ｘ２１．６０３Ｅ－００３ １ １．６０３Ｅ－００３ １．４６ ０．０５０７Ｘ３２．３４９Ｅ－００５ １ ２．３４９Ｅ－００５ ０．０２２ ０．０３３４﹡Ｘ１Ｘ２２．１７８Ｅ－００５ １ ２．１７８Ｅ－００５ ０．０２０ ０．００２６＊＊Ｘ１Ｘ３２．６４５Ｅ－００６ １ ２．６４５Ｅ－００６ ２．４５３Ｅ－００３ ０．０３５６＊Ｘ２Ｘ３１．７４８Ｅ－００４ １ １．７４８Ｅ－００４ ０．１６ ０．６９５７Ｘ１２ ０．０７６ １ ０．０７６ ７９．２９ ０．０００１＊＊Ｘ２２ ０．０５７ １ ０．０５７ ５２．４１ ０．００２３＊＊Ｘ３２ ０．０７０ １ ０．０７０ ６５．２１ ０．０００１＊＊残差０．０１１ １０ １．０７８Ｅ－００３失拟误差０．０１１ ５ ２．１５７Ｅ－００３ ０．７０ ０．２８３０纯误差０．００３ ５ ０．００３总和０．１８ １９２．３．３ 双因素交互作用分析 由表３知，回归模型Ｐ值＜０．０００１，可知该模型高度显著，可以用来进行预测，模型失拟项不显著，说明该模型选择合适［１０］；因素Ｘ１对黑豆多糖得率的线性效应是极显著，Ｘ２的影响不显著，而Ｘ３影响显著。