常 州 大 学
现代化学研究进展结业报告
题目： 金属酶—锌酶的研究进展
姓名： 唐李志鹏
专业： 有机化学
生物体系中含有许多种金属离子，如Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Na+等。不同的金属离子在生物体系中的存在方式是不同的，其中有些金属离子与某些特定的生物分子有固定或相对固定的结合，只有结合在一起才能发挥特定的功能，如金属酶和金属蛋白中的金属离子就是如此。金属酶就是必需有金属离子参与才有活性的酶，也就是有金属离子的酶，它们在各种重要的生化过程中完成者专一的生化功能，金属酶实际上是一种生物催化剂，它们使得生物体内一系列复杂的化学反应能够在常温常压中性介质条件下顺利地完成。金属酶的种类很多，以含锌、铁、铜的酶最多。
在生物体内锌离子的含量仅次于铁，在微量元素中位居第二。锌离子具有如下的特性：良好的Lewis酸性；本身没有氧化还原活性（d10电子结构）；良好的溶解性；毒性低等。因此，锌在生物体内的分布和活动范围都很广，目前已经知道的氧化还原酶、转移酶、水解酶、异构化酶、裂解酶和连接酶中均发现含锌的酶存在。在这些金属酶中，锌一般都位于其活性中心，但是有的直接参与酶的催化反应，有的则不直接参与，而是起到稳定结构等其他作用。在生理条件下，Zn2+不会被氧化或还原，能在生物介质中始终保持二价离子态。与其他金属离子相比，Zn2+的毒性非常低，并且生物体对Zn2+摄入、排出与体内分配的调节机制非常有效，很少出现锌中毒现象。由于锌具有独特的优越性，因此广泛地参与了蛋白质、酶、核酸、糖类、脂类的代谢与基因转录的调控等最基本、最重要的生化过程。如下图是常见的几种锌酶，其中研究最多的是碳酸酐酶，羧肽酶，碱性磷酸酯酶等。
碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase CA）：碳酸酐酶是一类分布广泛的含锌金属酶, 它能可逆性地催化CO2 的水合反应, 产生参与人体多种生理功能的HCO3- 及H+ 。自从1933 年首次从牛红细胞中纯化得到第一个碳酸酐酶以来, 到目前为止, 除了真菌外, 其他生物体中都已发现了该类酶的存在。碳酸酐酶最重要的生理功能是催化二氧化碳的水合作用。在人和动物体内，由碳酸酐酶催化CO2水合生成HCO3-，当HCO3-随血液循环到肺泡后，又由碳酸酐酶催化使之解离为CO2排出体外。在没有催化剂的情况下，CO2和HCO3-的转换非常慢，而碳酸酐酶的存在可以使二氧化碳水合和脱水反应的速度分别加快13000倍和25000倍。碳酸酐酶是已知金属酶中催化转换数最高的酶之一，它可以在2 ms内使95%的CO2转换为HCO3-，即：
根据碳酸酐酶氨基酸序列的不同, 人们主要将其分为α、β、γ、δ、ε五种不同类型的酶。其中α-CAs 存在于脊椎动物、细菌、藻类及绿色植物的胞浆中; β-CAs 存在于高等植物及藻类叶绿体中, 对植物光合作用过程中CO2
的获取及CO2 浓度的维持有着必不可少的作用; γ-CAs 则主要存在于太古细菌及一些细菌中; δ-CAs 主要存在于海洋硅藻中; ε-CAs 是近年来才确定的类型, 主要存在于蓝细菌及一些化能自养型细菌中（*）。
下图是碳酸酐酶晶体结构，整个蛋白链折合成椭球状，其二级结构中主要为β折叠片，但也有部分的α螺旋。
下图是活性中心锌离子周围的结构。其中活性中心中含有一个锌离子，与来自蛋白链中3个组氨酸的咪唑氮原子配位，另外还有一个配位水分子，形成的四面体结构
碳酸酐酶中配位水分子的pKa值大约为6.8，对催化功能至关重要，如果将水分子从第四配位点取代，碳酸酐酶的催化活性会受到抑制。常见的碳酸酐酶抑制剂包括卤素离子、羧酸根、酚、醇、咪唑、羧酸酰胺、硫酰胺、硫氰酸根等，这些分子或离子能不同程度地抑制碳酸酐酶的催化活性。
碳酸酐酶的应用有三点如下：
1.青光眼 CAⅡ抑制剂，作为治疗青光眼的药物，按其发展过程和药理作用分为三代：第一代口服型如乙酰唑胺，第二代局部用型如多佐胺及布林唑胺，第三代长效无刺激局部用型。
2.骨质疏松症 骨吸收所必需的酸性微环境, 就是通过破骨细胞中所含有的CAⅡ 形成的，所以抑制该酶活性可以降低破骨细胞的骨吸收作用。
3.癌症 CAⅨ 主要存在于癌细胞中, 而在正常细胞中却没有发现其存在，于是寻找它的抑制剂或探寻其抑制剂与癌症治疗之间的关系也成为有关碳酸酐酶研究的热点。
羧肽酶（Carboxypeptidase CP）在生物体系中催化水解蛋白链的酶主要分为两种：催化水解蛋白链C末端氨基酸残基的羧肽酶和断裂蛋白链N末端肽键的氨肽酶。其中研究较多的是羧肽酶（CP）。其催化的反应表示如下： 其中如果R中含有芳香基团，则称之为羧肽酶A（CP-A）；如果R为碱性基团，则称之为羧肽酶B（CP-B）。
羧肽酶A（CP-A）是目前研究最多，了解最清楚的羧肽酶。它首先于1937年分离得到，是第1个被发现的金属蛋白酶及第2个被发现的Zn2+ 依赖蛋白酶。在反刍动物中，CP-A易于与胰凝乳蛋白酶原及蛋白酶原E形成三元复合体，在非反刍动物中，CP-A以单体形式存在或与蛋白酶原E形成二元复合体；而CP-B仅以单体状态存在。 羧肽酶B(CP-B)最先在自溶的牛和猪胰腺中发现。
牛胰腺羧肽酶A中，蛋白链由307个氨基酸残基组成，并含有一个单核锌的活性中心，其中锌离子为5配体，2个氮原子来源于蛋白链中组氨酸残基，另外谷氨酸残基侧链上的羧酸根以双齿形式与锌离子配位，除此之外还有一个配位水分子。但这个水分子结合力很弱，当有其他双齿配体时，便会被取代。
下图分别是活性中心锌离子周围的结构和牛胰腺羧肽酶A的晶体结构。
羧肽酶的应用有两点如下：
1.甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)是常用的抗肿瘤药物之一，但它对骨髓及胃肠道的强毒性影响了其治疗效果。为此有人提出了新的抗体导向酶一前药疗法。此疗法利用抗体作为载体携带前药的专一活化酶，选择性的结合于肿瘤部位，使无毒性的前药区域性地在肿瘤组织内转化为具有活性的药物分子。CP-A即被用为识别前药的专一活化酶，它特异性地切割前药的特定残基，使其在肿瘤组织活化，这样既增加了药物的特异性，减少了它对正常组织的毒副作用，还可产生旁观者效应。 2.Papp等人比较了老年痴呆患者和正常人脑内的CP-B表达水平及分布情况，结果表明CP-B可以清除β-淀粉在脑细胞内的积累及其毒性，对保护神经元免受降解具有重要作用。
碱性磷酸酯酶（Alkaline Phosphatase AP）：上面介绍的碳酸酐酶和羧肽酶都是活性中心只有一个金属锌离子。在生物体系中除了这些单核金属酶之外，还有一些酶在其活性中心内还有2个或2个以上的金属离子。碱性磷酸酯酶（alkaline
phosphatase）就是其中一个。
碱性磷酸酯酶广泛存在于从细胞到高等动物的各种生物体内，是迄今为止了解最多的双核金属酶。它的主要生物功能是催化磷酸单酯水解产生醇或酚和游离的磷酸根离子。
正如其名一样，该酶在碱性条件下催化活性最佳，最适PH约为8。大肠杆菌碱性磷酸酯酶是典型的碱性磷酸酯酶。1961年由Schwartz在大肠杆菌中发现。
从结合有磷酸根的大肠杆菌碱性磷酸酯酶的X衍射结构可以看出，活性中心的2个锌离子的配位环境是不同的。2个锌离子通过磷酸根离子的2个氧原子桥联在一起。而在没有结合磷酸根离子的天然碱性磷酸酯酶，2个锌离子之间没有桥联基团。镁离子不直接参与催化作用，而只是起到稳定酶结构的作用。
下图分别是结合有磷酸根离子的大肠杆菌碱性磷酸酯酶和活性中心的结构
碱性磷酸酯酶的应用：碱性磷酸酯酶在医学和分子生物学等领域有广泛的用途。在临床医学上, 测定血清中AP 的活力已成为诊断和监测多种疾病重要手段。AP 主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查, 患这些疾病时, 肝细胞过度制造AP, 经淋巴道和肝窦进入血液, 同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍, 反流入血而引起血清AP 明显升高。在免疫学研究方面,
已广泛应用AP 标记抗体进行酶联免疫荧光反应( ELISA) 和Western 印迹分析,
就是将AP与显色剂或去磷酸化后能发光的底物相互作用来揭示靶与检测酶复合物的存在。在动物饲养和疾病诊断方面, AP是反映成骨细胞活性、骨生成状况和钙、磷代谢的重要生化指标。钙、磷供应不足对动物的影响主要表现为骨结构异常、软骨病、食欲降低、生长迟缓、生产性能下降等。国内外研究一致认为骨型AP是反映骨改变全过程最正确的指标, 其特异性、灵敏度及准确性优于其它物质的检测。
锌酶是生物体内一类非常重要的酶，在医学、分子生物学等方面有非常广的前景。目前还只是对少数几种锌酶有了比较深入的了解，还有许多锌酶有待大家的共同研究！