・ｌ｝】国卒　｝】杂志２０１（）年２，｛第５卷第２期皿　丁苯酞对缺血性脑损伤作用的　细胞靶点研究　一赵嘉　，李玲　，裴中　，张波　，魏欢　，黄￣ｎＯＩＩ　

【摘要】　目的　研究丁苯酞对缺血性脑损伤产生作用的准确细胞类型。　方法　分别使用大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞（Ｒａｔ　ａｄｒｅｎａｌ　ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｅｃｙｔｏｍａ，ＰＣ１２）和大鼠动　脉内皮细胞（ｒａｔ　ａｒｔｅｒｙ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ，ＳＵＶＥＡＥＣ）构建氧气葡萄糖剥夺一再灌注损伤模型，通过噻　唑蓝ｆ５　（４，５一ｄｊｍｅｔｈｙ　ａｚｏＩｅ　２　ｙ】）－２，５　ｂｉｐｈｅｎｙｌ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ，ＭＴＴ］进行细胞活性检测，　观察单纯损伤细胞与各剂量丁苯酞处理后的细胞活性。同时，采用１，１二苯基－２苦基偕腙肼（１，　１一ｄｉＤｈｅｎｙｌ＿２一ｐｉｃｒｙ】ｈｙｄｒａｚｙＩ，ＤＰＰＨ）法检测自由基清除活性。　结果　丁苯酞各剂量组对ＰＣ１２和ＳＵＶＢＡＥＣ的细胞活性均无明显影响，均不能抑制自由基离子。丁苯　酞处理使经受氧气葡萄糖剥夺一再灌注损伤的ＳＵＶＲＡＥＣ￣ｅ胞活性增加约１５％，约９０％的细胞活性得到　有效保护，并具有剂量依赖性；而对ＰＣｉ２的细胞活性则无明显作用。　结论　丁苯酞对ＰＣ１２和ＳＵＶＲ，ＡＥＣ．￣无毒性作用，不具有直接清除自由基的能力；丁苯酞主要作用于　血管内皮细胞，而对神经元的作用相对较弱。　【关键词】　丁苯酞；卒中；神经元；内皮细胞　

Ｔｈｅ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　Ｔａｒｇｅｔ　Ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒ　ＤＬ一３－ｎ－Ｂｕｔｙｌｐｈｔｈａｌｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ　Ａｇａｉｎｓｔ　Ｉｓｃｈｅｍｉｃ　Ｂｒａｉｎ　Ｉｎｊｕｒｙ　ＺＨＡ０　Ｊｉｎ　．ＬＩ　Ｌｉｎｇ，ＰＥｌ　Ｚｈｏｎｇ，ｅｔ　ａ１．＊Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＮｅｕｒｏｌｏｇｙ　Ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｕｎ　Ｙａｔ—Ｓｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１００８０，Ｃｈｉｎａ　

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｔｙｐｅｓ　ｆｏｒ　ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＬ一３一ｎ—ｂｕｔｙｌｐｈｔｈａｌｉｄｅ　ａｇａｉｎｓｔ　ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｂｒａｉｎ　ｉｎｊｕｒｙ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　Ｏｘｙｇｅｎ—Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ—Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｍｏｄｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｃｒｅａｔｅｄ　ｉｎ　ｒａｔ　ａｄｒｅｎａｌ　ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ（ＰＣ　１２）ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｒａｔ　ａｒｔｅｒｙ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａ１　ｃｅｌｌｓ（ＳＵＶＲＡＥＣ）ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＤＬ一　３－ｎ—ｂｕｔｙｌｐｈｔｈａｌｉｄｅ　ｏｎ　ｓｔｒｏｋｅ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｅｌｌ　ｔｙｐｅｓ　ｗａｓ　ａｓｓｅｓｓｅｄ　ｕｓｉｎｇ　３－ｆ４．５一ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｅ一２一　ｙ１）一２，５一ｂｉｐｈｅｎｙｌ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）ａｓｓａｙ．Ｔｈｅ　ｄｉｒｅｃｔ　ｆｒｅｅ—ｒａｄｉｃａｌ　ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ＤＬ一３一ｎ—ｂｕｔｙｌｐｈｔｈａｌｉｄｅ　ｗａｓ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　１，１－ｄｉｐｈｅｎｙｌ一２一ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ（ＤＰＰＨ）ａｓｓａｙ．　Ｒｅｓｕｉｔｓ　Ｄｉｆｉｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＤＬ一３一ｎ—ｂｕｔｙ１Ｄｈｔｈａｌｉｄｅ（１／１０／１ＯＯＢｍｏｌ／Ｌ）ｄｉｄ　ｎｏｔ　ｈａｖｅ　ａｎｙ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｃｅｌｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ．ＤＰＰＨ　ａｓｓａｙ　ｄｉｄ　ｎｏｔ　ｒｅｖｅａｌ　ａｎｙ　ｄｉｒｅｃｔ　ｆｒｅｅ—ｒａｄｉｃａｌ　ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ＤＬ一３一ｎ—ｂｕｔｙｌｐｈｔｈａｌｉｄｅ．ＤＬ一３一ｎ—ｂｕｔｙｌｐｈｔｈａｌｉｄｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ＯＧＤ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｄｅｃｒｅａｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｉｎ　ＳＵＶＲＡＥＣ　ｂｕｔ　ｎｏｔ　ｎｅｕｒｏｎ—ｌｉｋｅ　ＰＣ　１　２　ｃｅｌｌｓ．ＤＬ一３一ｎ—　ｂｕｔｙｌｐｈｔｈａｌｉｄｅ　ａｔ　ａｎ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｃｏｕｌｄ　ｒｅｓｃｕｅ　１　５％ｍｏｒｅ　ｃｅｌｌｓ　ｔｈａｎ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｉｔ　ａｎｄ　ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ　９０％ＳＵＶＲＡＥＣ　ｉｎ　ｔｏｔａｌ　ｗｅｒｅ　ａｌｉｖｅ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＤＬ－－３－－ｎ－－ｂｕｔｙｌｐｈｔｈａｌｉｄｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｐｒｏｔｅｃｔｓ　ＳＵＶＲＡＥＣ　ａｇａｉｎｓｔ　ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｉｎｊｕｒｙ　ａｎｄ　ｄｏｅｓ　ｎｏｔ　ｈａｖｅ　ａ　ｄｉｒｅｃｔ　ｆｒｅｅ　ｒａｄｉｃａｌ　ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ　ｐｒｏｐｅｒｔｙ．　［Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ］ＤＬ一３一ｎ—ｂｕｔｙｌｐｈｔｈａｌｉｄｅ，Ｓｔｒｏｋｅ，Ｎｅｕｒｏｎ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　

多个临床试验结果显示丁苯酞对急性缺血　性卒中具有显著疗效　。同时，大量的动物实验　也证实其对急幔性脑缺血有治疗及预　Ｊ用Ｈ。　已有的实验表明丁苯酞对脑缺血损伤有多方面　的影响，但对其主要作用部位和机制的研究依　然相当有限，尤其是作用的确切靶点仍未阐明。　因此，我们用模拟急性脑缺血的离体氧气葡萄　糖剥夺一再灌注模型来研究丁苯酞的效应靶点　及可能通路，从而推断其产生抗缺血损伤作用的　准确部位，为临床治疗提供更多理论依据。　

・论著・　作者单位　５１　００８０广东省广州市　中山大学附属第一医院　神经科　广州医学院第二附属医　院　昆明市延安医院　通信作者　黄如训　ｈｒｘ９９８＠ｙａｈｏｏ．ｔｏｍ．ｃｎ　１材料与方法　１．１细胞培养采用大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞　瘤细胞（ｒａｔ　ａｄｒｅｎａｌ　ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ，　ＰＣ１２）（来源自ＢｉｏＭａｒｔ细胞库，细胞库号　ＤＳＭＺ　ＰＣ一１２）作为体外研究神经元的细胞　体系，８５％ＲＰＭＩ　１６４０培养基＋ｌ０％马血清＋５％　胎牛血清于３７￣Ｃ　５％ＣＯ，培养箱孵育；采用大鼠　动脉内皮细胞（ｒａｔ　ａｒｔｅｒｙ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ，　ＳＵＶＲＡＥＣ）（来源￣ｔＢｉｏＭａｒｔ细胞库，细胞库　号ＤＳＭＺ　ＡＣＣ－ＳＵＶ）作为体外研究脑血管内　皮的细胞体系，９０％ＲＰＭＩ　１６４０培养基＋１０％胎　牛血清于３７￣Ｃ　５％Ｃ０，培养箱孵育。待细胞生长　至７０％－８０％用于实验。　１．２离体氧气葡萄糖剥夺一再灌注模型的建立　把生长状态良好的ＰＣ１２及ＳＵＶＲＡＥＣ分别接　种于９６：｛Ｌ板，待其生长至７０％～８０％时将其正常　培养基换成缺氧液（２　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣ１２　０．２２１　ｇ，　３　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣ１　０．２２４　ｇ．１５６　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１　９．１１６　ｇ，１．２５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＨ　２ＰＯ　４　０．１７　ｇ，　１０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ　２．３８３　ｇ，２　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＳＯ　０．４９２　ｇ加入去离子水达ｇｉｌｌ　Ｌ容量，过　滤后使用）　】，再将其置于一个２　Ｌ容器中，向　内通人９５％Ｎ２＋５％ＣＯ２混合气体３０　ｍｉｎ，随　后将容器密闭并放入３７　ｏＣ　５％ＣＯ２培养箱中　４－６　ｈ，以使细胞损伤达３０％左右为准。缺氧后　把装有细胞的９６孔板从密闭容器中取出并换　入各自的正常培养基，恢复氧气和葡萄糖供应　２４　ｈ后进行实验指标的检测。　１．３实验分组将丁苯酞油剂（丁苯酞　含量＞９　９．０％，石家庄恩必普药业有限　公司提供）１　９．０　ｍｇ溶于５００　ｌ二甲基亚　砜（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，ＤＭＳＯ）中，得到　２００　ｍｍｏｌ／Ｌ原液，从中取ｌＯ０　ｌ溶于２０　ｍｌ磷　酸盐缓冲液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ—ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ，　ＰＢＳ）中并过滤，以达到１　ｍｍｏｌ／Ｌ的终浓度，　使用时按所需浓度稀释。丁苯酞处理的各组于　缺氧前３０　ｍｉｎ）ｌＨ入相应浓度的药物。　１．３．１丁苯酞对细胞的毒性作用研究ＰＣ１２和　ＳＵＶＲＡＥＣ分别分成空白对照组、丁苯酞小剂　量（１　ｍｏｌ／Ｌ）、丁苯酞中剂量（１０　ｍｏｌ／Ｌ）、　丁苯酞大剂量（１Ｏ０　ｍｏｌ／Ｌ）。　１．３．２丁苯酞对细胞氧气葡萄糖剥夺一再灌　注损伤的作用研究　（１）细胞活性检测：ＰＣ１２　和ＳＵＶＲＡＥＣ分别分成空白对照组、缺氧　组、丁苯酞小剂量（１　ｍｏｌ／Ｌ）＋缺氧组、丁苯　酞中剂量（１０　ｍｏｌ／Ｌ）＋缺氧组、丁苯酞大剂　量（１００　ｍｏｌ／Ｌ）＋缺氧组；（２）细胞凋亡检测：　ＰＣ１２和ＳＵＶＲＡＥＣ分别分成空白对照组、缺氧　组、丁苯酞有效剂量（１００　ｍｏｌ／Ｌ）＋缺氧组。　１．３．３丁苯酞清除自由基的活性研究分为　空白对照组、溶剂对照组、丁苯酞小剂量　（１　ｍｏｌ／Ｌ）、丁苯酞中剂量（１０　ｍｏｌ／Ｌ）、丁　苯酞大剂量（１００　ｍｏｌ／Ｌ）。　１．４方法　１．４．１细胞活性检测一一噻唑蓝［３一（４，　５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｅ一２一ｙ１）－２，５－ｂｉｐｈｅｎｙｌ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ，ＭＴＴ］法将ＰＣ１２　和ＳＵＶＲＡＥＣ分别接种于９６孔板，每组使　用６个副孔，待处理完成后各：ｆＬ￣Ｉ入１８０　ｌ　１　６４０＋２０　ｌＭＴＴ，在３７℃温箱中避光孵　育４　ｈ后吸出ＭＴＴ，加入１　０　０　ｌ二甲基亚　砜（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，ＤＭＳＯ）溶解结　晶，摇床混匀１５　ｍｉｎ，于荧光／化学发光分析　仪（ＢＩＯ－ＴＥＫ）以５４０　ｎｍ波长检测各组分光度，　将各组分光度与空白对照组相比较，从而计算　各组细胞的存活比例。　１．４．２细胞凋亡检测一一ＤＡＰＩ染细胞核法将　ＰＣ１２和ＳＵＶＲＡＥＣ分别接种于直径３５　ｍｍ的　培养皿中，待处理完成后使用４％多聚甲醛冰　上浸泡１５　ｍｉｎ以固定细胞，ＰＢＳ冲洗２遍后加　入２．５￣ｇ／ｍｌ　４。，６－二脒基一２一苯基吲哚（４　，　６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ，ＤＡＰＩ），在　室温中染色３０　ｍｉｎ。将每个培养皿划分为９部　分，每部分随机抽取１－２个视野，使用荧光显微