基基因因疫苗疫构苗建的的基本构途建径
基因疫苗的构建
一、构建基因疫苗的载体 载体是将抗原基因导入到机体细胞的必要工
具。 1.载体的分类 按照载体功能可分为克隆载体和表达载体； 按照载体来源可分为质粒、噬菌体、黏粒和
病毒载体等。 2.常用于构建基因疫苗的载体
二、基因疫基苗因的疫构苗建的方构法建
1.抗原基因和载体的制备
基因疫苗经过黏膜和皮肤组织免
（1）直接免疫 旅美中国科学家范泓然用皮肤涂
抹法给小鼠接种乙肝疫苗取得成功， 且检测其效果可以和所用的肌肉注射 相媲美。黏膜淋巴结提供了浆细胞抗 体型转化与Th0细胞向Th2细胞定向 分化的微环境。基因疫苗经过黏膜免 疫可以很好地激活B细胞分泌IgA，同
（2）用重组减毒胞内菌系统 采用志贺氏菌、沙门氏菌或李斯特菌等
基因疫苗被称为第三代疫苗。
1990年wolff等从事于基因治疗工作时，用 外源性重组质粒给小鼠肌肉注射后，质粒 被摄取并能在体内至少两个月稳定地表达 所编码蛋白。
1991年Williams等发现外源基因输入体内 的表达产物可诱导产生免疫应答。
1992年Tang等将表达人生长激素的基因质 粒DNA导入小鼠皮内，小鼠产生特异性抗 体，从而提出了基因免疫的概念。
获得需要的目的基因常用的方法： （1）直接从生物体) ，从中调用目的基因； （2）以mRNA为模板，反异性
基因疫苗的构建
基因表达载体的组成：
携带基因疫苗重组减毒沙门氏菌诱发机体免疫应答
重组减毒沙门氏菌的携机制带的基因疫苗激发机 体的细胞免疫和体液免疫的机制还不完全
清楚。 可能途径一：DCs 和巨噬细胞吞噬侵入肠
转染：将质粒或者以它为载体构建的重 组子导入真核细胞的过程。
感受态：细菌经过CaCl2溶液处理和短 暂热激后，容易摄入外源DNA，这种状态 称为感受态。其原理是细菌处于0℃、低 渗CaCl2溶液中时，细胞壁和细胞膜通透 性增加。此时转化混合物中的DNA形成抗
基因疫苗的构建
4.重组质粒的筛选与鉴定 一般重组质粒鉴定主要按照表型筛选、
由于这个过程实际上是相当复 杂的，所以人们对一些具体的细 节并不清楚。下面通过对基因疫 苗经过肌肉组织和黏膜免疫的抗 原呈递途径来说明基因疫Fra bibliotek的工 作原理。
基因疫苗经黏膜和皮肤组织免疫的抗原 皮肤或者黏呈膜递是具有高水平免疫
监视系统的组织，黏膜淋巴组织的功 能：参与粘膜局部免疫应答和产生分 泌型IgA。而且在免疫动物时比较方 便，尤其是大面积预防时，所以关于 基因疫苗通过皮肤或黏膜免疫激活机 体免疫反应机制的研究也比较活跃。
酶切鉴定和测序鉴定的顺序进行 （1）插入片段鉴定：酶切鉴定；PCR鉴定。 （2）插入片段方向性鉴定：可利用联合酶切
方案进行目的基因的插入方向鉴定。 （3）DNA序列测定：末端终止法测序；自
动测序仪测序
基因疫苗的构建
三、重组质粒在真核细胞中的表达与检测 1.重组质粒导入真核细胞的方法
磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、脂质体介导 等方法都可以用来将外源质粒导入真核细 胞，其中脂质体介导容易成功，是最常用 的方法。 2.抗原基因在真核细胞中表达的检测 （1）蛋白水平的检测：免疫沉淀法检测表达
重组减毒胞内菌系统，通过粘膜自然感染途 径运送 DNA 疫苗是一类很好的方法。因为 它们可以将基因疫苗直接呈送给 APCs ，所 以这种方法运送效率高、免疫方法简单、免 疫效果好，能同时激活粘膜免疫和全身免疫 ，并可获得对载体菌的免疫等优点。
减毒沙门氏菌通过自然感染的方式高效 地将基因疫苗直接运送给体内的抗原提呈细
为了保证抗原基因的 定向正确插入，只有以 正确的方向插入表达载 体读框启动子下游才能 表达抗原基因，故抗原 基因两端应具有不同的 酶切位点，在设计时须 注意这点。
复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因
2.抗原基因与载体的连接
连接的方式可分为 粘性末端连接和平末端 连接两种，其中前者连 接效率较高，使用比较 多。连接反应时应考虑 反应体积、抗原基因与 载体的比例、温度和时 间和酶量。
1996年2月5-8日，美国马里兰州
定义
核酸疫苗(nucleic acid vaccine),也称基因 疫苗(genetic vaccine),是指一类将抗原基因重 组到表达载体上的重组质粒疫苗，经肌肉注射 或黏膜免疫等方法导入宿主体内，通过宿主细 胞表达抗原蛋白，诱导宿主细胞产生对该抗原 蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目 的。
粘性末端连接
质粒
目的基因
用同一种或两种
限制性内切酶酶切
DNA连接酶 本法适用于在
质粒和目的基
因上有相同单
重组质粒
或双酶切位点
平末端连接
质粒
产生平末端的 内切酶
目的基因 DNA连接酶
核酸酶S1
重组质粒
本法适用于在质粒 和目的基因上没有 相同的酶切位点！
3.重组质粒基转化因受疫体苗菌的构建
转化：将质粒或者以它为载体构建的重 组子导入细菌的过程。
1993年Ulmer等将注射技术用于研究流感
关于核酸免疫的国际会议
1994年5月17-18日，瑞士日内瓦 。WHO主办。主题：核酸疫苗。
1995年2月16-17日，美国马里兰 州，Bethesda（NIH）。主题：基 因疫苗和核酸疫苗战略。
1995年4月6-9日，美国弗吉尼亚州 。主题：DNA疫苗：疫苗学的新时 代。
核酸疫苗
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核酸疫苗的发展史
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核酸疫苗定义
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核酸疫苗的构建
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核酸疫苗的作用原理
5 核酸疫苗的优缺点和应用现状
疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等） 及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方 法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。
人们将多种灭活或减毒疫苗称为第一代疫苗。 将用基因工程的方法研制的亚单位疫苗称为第二代疫 苗。 理想疫苗应具备的特征有：安全、廉价、热稳定性好， 含有多种具有保护作用的免疫原，最好是一次口服即可生 效。目前前两代均不能满足上述标准。故基因疫苗应运而 生。