《食品工业科技》　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　１９９８·Ｎｏ·３　

灵芝多糖的分离与纯化　

罗立新　姚汝华　少奇　

（华南理工大学生物工程系，广州５１０６４１）　Ｑ牛ｆ　

行研究，采用冷、热水、冷、热碱液分别从灵芝菌丝体和子　

实体中提取灵芝多糖，使多糖获得初步分级。还比较了浸提温度、加水比、浸提次数、提取时间等　

因素对粗提的影响，选定了适宜的提取工艺，并选用层析法纯化了多糖，使多糖纯度达到９６％以　

上。　

关键词灵芝多糖分离纯化　

Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｏｆ　

ｓｔｕｄｉｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ．Ｔｗｏ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｆｒｕｉｔ　ｂｏｄｙ　ａｎｄ　ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ　

ｍｙｃｅｌｉａ　ｏｆ　Ｇａｎｏｄｅｒｍａ　Ｌｕｃｉｄｕｍ（ＧＬ）ｂｙ　ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｃｏｌｄ／ｈｏｔ　ｗａｔｅｒ　ａｎｄ　ｃｏｌｄ／ｈｏｔ　ａｌｋａｌｉ　

ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｆａｃｔｏｒｓ，ｅ，ｇ，ｔｉｍｅ　ａｎｄ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，　

ｖｏｌｕｍｅ　ｏｆ　ａｄｄｉｎｇ　ｗａｔｅｒ，ｅｘｔｒａｃｔ　ｔｉｍｅｓ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ，ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｅｘ—　

ｔｒａｃｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ，ｔｈｅ　ｃｒｕｄｅ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｗａｓ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｇｒａｄｅｄ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｃｏｌｕｍｎ　

ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ａｓ　ａ　ｒｅｓｕｌｔ，ＧＬＰ　ｗａｓ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｕｐ　ｔＯ　９６　．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｇａｎｏｄｅｒｍａ　Ｌｕｃｉｄｕｍ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　

１前言　灵芝是滋补强壮、扶正固本的珍贵药品［１］，灵　

芝及其多糖广泛应用在医药、食品等领域　］，市场　

需求量与日俱增。但目前灵芝多糖的生产几乎都是　

从子实体中提取，灵芝野生资源稀缺，人工栽培的　

周期长（２～３个月以上），占地面积大，又受季节限　

制，从而影响了灵芝的充分利用；而利用深层培养　

技术生产灵芝，周期短（７～ｌＯｄ左右）、成本低、产　

量大，具有工业化生产前景。灵芝菌经深层培养产　

生了大量的菌丝体和发酵液，它们的化学组成复　

杂，种类繁多，灵芝多糖是其中的有效组分之一。选　

取合适的分离纯化方法，提取灵芝多糖是本研究的　

最终目的。本文对提取工艺进行了深入研究，使多　

糖获得了分级分离。实验结果表明，灵芝菌丝体完　

全可以取代子实体，作为灵芝多糖生产的新资源。　

２材料与方法　

２．１菌种与试剂　

赤芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ　Ｌｕｃｉｄｕｍ）ＡＳ．５．６５，由中科　

院微生物研究所提供；　

广东省自然科学基金资助项目（Ｂ６—１２８—２２８）　

·４·　赤芝子实体，从市场购得；　

ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ一２５、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ一２００均为　

Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司产品，其余试剂均为国产分析纯试　

剂。　

２．２上清液胞外多糖的提取工艺流程　发酵液　！　墨　透析液　上清液　

沉淀物　丙酮、乙醚洗涤　Ｐ２Ｏ５干燥　胞外多糖　

２．３菌丝体胞内多糖的提取口　工艺流程（见下页）　

２．４粗多糖的纯化［ｄ　

粗多糖经Ｓｅｖａｇ法　和蛋白酶法联合脱蛋白　

后，经ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ一２５（Ｃ１一型）柱层析，用　

ＮａＣ１溶液进行梯度洗脱，再经Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ一２００柱　

层析纯化，即得纯多糖。　２．５多糖的纯度鉴定　

采用Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ一２００柱层析法［６］。　

２．６多糖的糖含量测定　

以苯酚～硫酸法　测定多糖的总糖含量，以葡　

萄糖为标准。　Ｐ　Ｇ　

Ｐ　维普资讯 http://www.cqvip.com ３结果与讨论　３．１　发酵液胞外多糖的粗提　将发酵完毕的发酵液进行离心分离　］，上清液　

在不大于９０￣Ｃ条件下浓缩，再将浓缩液置透析袋　

中，流水透析直至透析液无还原糖为止，加入了３　

倍体积的９５　乙醇，５～１０’Ｃ下静置１２ｈ以上，沉　

淀粗多糖，沉淀物分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤　

后，真空抽干，然后置Ｐ　Ｏ　干燥器中进一步干燥，　

上清液　得到胞外粗多糖干品。ｌｌ发酵液可得胞外粗多糖　

７６０ｍｇ，经测定其多糖含量为６９．２　，蛋白质含量　

为２０．６　。　３．２菌丝体胞内多糖的粗提　将离心分离得到的菌丝体在６０￣Ｃ干燥、粉碎，　

每升发酵液得干菌体１５．１ｇ，再按上面介绍的方法　

把胞内多糖分成水溶性、冷碱提水溶、热碱提水溶　

三个组分。　

（热碱提水溶多糖）　堕　查鎏　塑　

３．２．１　菌丝体水溶多糖的提取　。　

３．２．１．１　热水浸提温度的影响　分别在５Ｏ、６Ｏ、　

７Ｏ、８Ｏ、９Ｏ℃五个温度下进行浸提，测定多糖含量，　

结果见图１。　

ＴｅｌＮ￣ｒＪｕｍ（－ｃ）　图１　浸提温度对多糖提取的影响　

从图１可看出，热水浸提温度对提取工艺有很　

大的影响，５Ｏ℃浸提下的多糖得率比８Ｏ℃浸提时　

低约５Ｏ　；当温度升至８Ｏ℃以上时，多糖得率的增　幅趋于平缓。而且温度过高，有可能破坏多糖的结　

构。因此，采用８Ｏ～９０℃作为热水浸提温度。　

３．２．１．２浸提加水比的影响分别在１Ｏ、２Ｏ、３Ｏ、　

４Ｏ、５Ｏ等加水比下进行浸提，然后测定多糖的含　量，结果见图２。　

从图２中看出，加水比是影响浸提的另一重要　

因素，加水比从１０：１增至４０：１时，多糖浸提几　乎达到完全。再增大加水比，对多糖的浸出无明显　

提高，反而会增加下一步浓缩工艺的负担，因此，选　

用４０：１的加水比较合理。　

图２加水比对多糖提取的影响　

３．２．１．３提取时间的影响　不同提取时间下提取　

液的多糖含量见表１。　

表１提取时间对多糖溶出的影响　

提取时间（ｈ）　１　１．５　２．０　２．５　３．０　多糖含量（ｍｇ）　２９０　２８５　２７８　２７０　２６４　相对提取率（　）　１００　９８．３　９５．７　９２．９　９０．９　

从表１可知，提取１ｈ即可将菌丝体中的多糖　

提取较完全。时间太长，可能引起糖结构的变化和　

破坏，甚至使其中的五碳环或六碳环裂解，导致多　

糖的含量下降。因此，提取时间采用１ｈ。　

·５·　维普资讯 http://www.cqvip.com ３．２．１．４提取次数的影响　１５．１ｇ菌体匀浆后　

用６００ｍｌ水分别提取４次，提取液浓缩至２５０ｍｌ，　

测其多糖含量，结果见表２。　

表２　菌丝体水溶多糖四次提取的结果　

提取次序　多糖含量（ｍｇ）　提取率（　）　１　２９６　８４．５　２　４１　１１．６　３　１２　３．４　４　２　０．５　

从表２可见，第一次提取得列８５　左右的糖，　

两次提取共得９５　以上的糖，以后的实验中将采　

用二次提取。　

３．２．１．５　乙醇浓度的影响　不同乙醇浓度下，提　

取液的多糖含量如表３。从表３可看出。９５　的乙　

醇沉淀多糖，提取完夺　以后采用９５　乙醇浓度来　

沉淀多糖。　

表３　不同乙醇浓度沉淀多糖的结果　

乙醇浓度（　）　多糖含量（ｒａｇ）　提取牢（　）　６０　２８６　８１．７　７５　３０２　８６．３　８Ｏ　３０９　８８．４　９５　３５０　１ｏ０　

综合上述因素，菌丝体水溶性多糖的提取工艺　

如下：菌丝体干燥、粉碎后，在８Ｏ～９０　Ｃ水浴中水　

煮抽提２次，每次１ｈ，浓缩后，取上清液，透析，加　

入３倍体积９５　乙醇沉淀，干燥即得粗多糖，１１发　

酵液可得菌丝体１５．１ｇ，水溶粗多糖５２０ｍｇ，其多　

糖含量为６７．３　，蛋白质含量为１９．５　，粗多糖得　

率为３．４４ｇ／１００ｇ干菌体。　

３．２．２菌丝体中冷碱提水溶多糖的提取　提取水溶性多糖后剩下的残渣，再用不同浓度　

的碱，在２５℃常温下提取两次，每次１ｈ，用９５％乙　

醇沉淀，测定其多糖含量，结果见表４。从表４可　

见，选用０．５ＭＮａＯＨ作为溶剂，效果较好，冷碱提　

水溶多糖１８０ｍｇ，其多糖含量为６８．９　，蛋白质含　

量为１８．２％，粗多糖得率为１．１９ｇ／１００ｇ千菌体。　

３．２．３菌丝体中热碱提水溶多糖的提取　

将冷碱提取后剩下的残渣，再用不同浓度的碱　

在６５　Ｃ下提取两次，每次１ｈ，然后用９５　乙醇沉　

淀，测定其多糖含量，结果见表５。　

表４冷碱提取多糖的结果　

ＮａＨＣＯ３　ＮａＯＨ　提取剂　０．１Ｍ　ｒ０．５ＭＩ１．０Ｍ　０．１ＭＩｏ．５Ｍ　Ｊ１．０Ｍ　多糖含量（ｍｇ）　３４　ｌ　１１３　ｌ　１０４　３７｛１２４　ｌ　１０６　相对提取率（　）　２７　４ｌ　９１　ｌ；ｇ３．９　２９．８ｌ　１００　Ｉ　８５．５　

·６·　表５热碱提取多糖的结果　

ＮａＨＣＯ　３　ＮａＯＨ　提取剂　０１Ｍ［０．５Ｍ［１．０Ｍ　０．１Ｍ［０．５Ｍ［１．０Ｍ　多糖含量（ｍｇ）　２８　ｌ　７７　ｌ　６９　３２『８２　ｌ　７１　相对提取率（　）　３４．２１　９３．９１　８４．２　３９．０Ｉ　１００　Ｉ　８６．６　

从表５得知，选用０．５Ｍ　ＮａＯＨ作为溶剂，效　

果最好。热碱提水溶多糖１２５ｒａｇ，其多糖含量为　

６５．６　，蛋白质含量为１　７．４　，粗多糖得率为　

０．８３ｇ／１００ｇ干菌体。　

３．３粗多糖的纯化　

将粗多糖样品溶于热水，按Ｓｅｖａｇ法用丁醇：　

氯仿：１：４混合振摇，脱去蛋白质，反复操作多　

次，直至丁醇氯仿层不浑浊为止。菌丝体和发酵液　

多糖脱蛋白较容易，不需蛋白酶处理，直接用Ｓｅ—　

ｖａｇ法就可以基本除去杂蛋白；而子实体多糖中所　

含蛋白较多，需先用蛋白酶处理，再用Ｓｅｖａｇ法除　

蛋白。　

除去杂蛋白的粗多糖，称取１ｇ，溶于大约１０ｍｌ　０．１ｍｏｌ／１　ＮａＣ１中，加入ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ　２５层　

析柱（２．５×２０ｃｍ）内，层析柱预先用０．１ｍｏｌ／１　Ｎａ—　

ｃ１平衡，上样后先用０．１ｍｏｌ／１　ＮａＣ１洗至无糖检出　

为止，然后采用梯度洗脱，即用５００ｍｌ　３．９ｔｏｏｌ／１　

ＮａＣ１对５００ｍｌ　０．１ｍｏｌ／１　ＮａＣ１进行洗脱，分部收　

集，每管收集８ｍｌ，流速１．７０ｍｌ／ｍｉｎ，用苯酚一硫　

酸法跟踪检测，结见图３。合并含糖部分，透析除去　

氯化钠，浓缩至最小体积，加入３倍量乙醇，经无水乙　

醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥，得到灰白色粉未。　

图３多糖的ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ一２５柱层析　

取样品５０ｒａｇ溶于最小体积的０．１ｍｏｌ／１　ＮａＣ１　

中，加样于Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ一２００层析柱（２．０×２０ｃｍ），　

用０．１ｍｏｌ／１　ＮａＣ１液洗脱，流速１０ｍｌ／ｈ，每管收集　

５ｍｌ，测定含糖部分，合并相同峰，经透析，乙醇沉　

淀，丙酮、乙醚洗涤，真空干燥，得到白色的多糖纯　

品，见图４。

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