色谱法在胶原蛋白分离着重介绍色谱法在胶原及水解胶原多肽的应用）它广泛存在于从低等脊椎动物线虫到哺乳动物机体的一切组织中骨韧带由于胶原分子的天然独特骨架骨胶原大量用于制明胶随着研究手段的日益现代化物理逐渐认识到胶原不仅具有合成高分子不可比拟的生物相而且具有一系列重要的生物学功能将其转化为高附加值的生物医学材料营养保健品胶原具有如下特征这一区段称为螺旋区段在X及Y位置上多是脯氨酸(Pro)(按遗传因子排列为GGNCCNCCN)王 碧女博士生现从事胶原蛋白的色谱分离研究298877017(3) 与别的基本成份相互作用目前已发现的胶原至少有19种不同类型ＩＩ其中I型胶原含量最高有关它的研究深受化学家关注procollagenËüÓÉÈýÌõëÄÁ´×é³É¼´α1(I)2 α2(I)α1(I)α2(I))γ-肽链实际上是原胶原分子深入了解胶原多肽特性胶原多肽的分离纯化工作要得到好的分离结果色谱技术和电泳技术是实践中分离纯化蛋白质最重要的和最常用的方法分析法本文介绍胶原蛋白的一般提取方法1 胶原蛋白的一般提取分离方法据报道从成熟组织中它可用酸或盐溶液从动物结缔组织中部分提取出胚胎组织例外前处理后的动物皮有机溶剂萃取去脂质中性盐溶液萃取中性盐可溶胶原稀酸萃取酸可溶胶原粗制不溶性胶原酶解碱处理微粉末化酶溶胶原碱溶性胶原微晶胶原图1 皮胶原提取法Fig1 Extraction of skin collagen胶原类型不同其分子尺寸和配糖的含量也不同表1Ö»ÓÐͨ¹ýÉ«Æ×¹ý³Ì²ÅÄܵõ½ÍêÈ«´¿»¯表1 I-(170α61)()85) α()95 1.2α2 胶原及其水解多肽的色谱分离法至今已发现19种不同类型胶原如血管壁型胶原软骨中主要含型胶原只分布在基膜中等最令人感兴趣的是不同类型胶原ʹËü³ÉΪѪ¹Ü·¢Éú¹ý³ÌµÄÓÕµ¼ÐźŲ»Í¬ÀàÐͽºÔ-ÉúÀí¹¦ÄÜ´æÔÚ²îÒì2.1 区域析出色谱法正如通过部分盐析能分离出某些单一类型胶原一样上世纪70年代末期Ehrlich报道了利用该技术对胶原初步分型的方法用含Tris缓冲溶液的一定浓度和体积的NaCl溶液间断的逐步洗脱结果分离出了和因区域析出色谱技术不能使胶原完全纯化2.2 离子交换色谱迄今为止纯化单一类型胶原及其水解多肽的较好方法早在70年代用含Tris-HCl缓冲溶液的NaCl溶液梯度洗脱分离胶原除去了型胶原中所混的其它蛋白多糖进一步在DEAE-纤维素柱上分离再用尿素-NaCl溶液二元梯度洗脱和1990年Kirsch等[4]在DEAE-纤维素柱上分离了来自于软骨的型胶原片段和型胶原进行纯化的报道上世纪70年代国外有研究者在CM-纤维素柱上非变性条件下型胶原得到了分离更多的报道是在CM-纤维素柱上分离水解的胶原多肽链及其片段1980年Dixit等[6]在CM-纤维素柱上型胶原分离成了三个组分分子量分别为140kDa和75kDa һЩÑо¿±íÃ÷Ô-½ºÔ-ÓÐÑо¿ÕßÔÚCM-纤维素柱上从pro α1pC α1α21993年金贵仙等[7]用NaAc溶液作起始缓冲溶液在CM-52阳离子纤维素柱上后来岳爱兵等也在该柱上对明胶中的不同构象组分进行了分离从文献来看国外一些研究者在Bio-Gel A 柱上从水解胶原中分离出α链近10年内型胶原的报道国内研究者开始逐渐利用凝胶色谱法测定明胶与胶原水解产物分子量分布并用该法测定了经预先级分的明胶的分子量分布以含叠氮化钠的蒸馏水为流动相用水凝胶色谱法测定了从铬革渣中按不同条件提取的胶原蛋白的分子量及分子量分布一般实验室难以达到国外的报道也不多见从文献报道可以看到Concanavalin¸ÎËØÕâЩÌîÁÏ·Ö±ðÊÊÓÃÓÚ·ÖÀ벻ͬÀàÐͽºÔ-»ò½ºÔ-¶àëÄÑùÆ·ÈܽâÓÚº¬5mmol/L CaCl 2的同一缓冲溶液中ConcanavalinÈ»ºóÔÚͬһ»º³åÈÜÒºÖÐÓÃ0.05mol/L α-甲基-D-甘露糖甙溶液连续洗脱一段时间ｐＨ＝７．５型原胶原中除去非糖蛋白型原胶原和据Sykes报道用硫醇活化的琼脂糖不仅可从缺乏半胱氨酸的材料中分离出原胶原例如应用该法分离将Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ组成的混合液中在60°C下加热30minÓÃͬһ»º³åÈÜÒº×÷Á÷¶¯Ïà½Ó׎«½µ½âµÄÔ-½ºÔ-ͬ»îÐÔµÄÁò´¼ÀàÇíÖ¬ÌÇÒ»Æðκ͵ØÕñÒ¡2hÓÃÆðʼ»º³åÈÜҺϴÍÑÐÍp-N胶原和原胶原被分离出然后用1.0mol/L NaCl的起始缓冲溶液作洗脱液,洗脱过程中再连续洗脱型原胶原和p-C胶原型原胶原型原胶原上世纪80年代开始出现应用肝素-琼脂糖柱分离胶原蛋白的报道型胶原(洗脱液组成型胶原的αγ链型胶原型胶原将牢固地键合在该柱上难以洗脱少见用疏水作用色谱分离纯化胶原蛋白的报道用一定浓度的(NH4)2SO4-KH2PO4洗脱型胶原但由于胶原水解产物的复杂性国内外用该法分离的报道甚少此外仅偶见几例反相色谱分离胶原及水解多肽的报道用含Tris-HCl的尿素溶液作洗脱液型胶原中分离出了αγ三个组分同时作者在该柱上分离了来自于基膜的1和α2两个未完全分开的峰在该柱上测定了明胶及改性明胶的分子量分布,后来又进一步将三根µ-Bondgel E-linear柱串联1995年Sato等[15]在Bakerbond PEIScout 柱上,用反相HPLC法对用NaCl-HAc溶液洗脱低聚体进行了分离1996年Mechling等[17]用高效凝胶色谱法用0.1%三氟乙酸为流动相型胶原多肽进行分离得到了α1α3三个组分用吡啶-HAc为洗脱液ＩＩSkinner [18]在由正烷基硅组成的Lichrospher柱上使人胶原的α1(I)α1(II)和α1(III)得到了分离用NaAc缓冲溶液作流动相结果得αγ1995年Fields等[20]用反相HPLC分离分析了人工合成的三股螺旋小型胶原在二苯基或无孔反相C18柱上小型胶原使之得到纯化综上所述国外研究者所做工作相对较多ｂ除溴化氰断裂肽外显然这种分离远不够深入几乎是空白可以说色谱法在该领域的研究工作空间广阔结合多维色谱从组成极其复杂的水解胶原中分离并制备出具有特殊生物功能的胶原多肽另一方面随着人们对胶原功能性质越来越深入的认识水解胶原多肽越来越多地应用于医药高档化妆品等领域利用色谱法分离测定胶原多肽的分子量分布理化性能的相关性进一步分离出特殊功能性胶原多肽美容保健品回用制革副废物具有重要意义。