现代医药卫生２０１７年６月第３３卷第１２期　Ｊ　Ｍｏｄ　Ｍｅｄ　Ｈｅａｌｔｈ，Ｊｕｎｅ　２０１７，Ｖ０１．３３，Ｎｏ．１２　

简易胶原酶消化法提取兔原代￣ｌｑ：ｆｌｔｔ胞及培养　・论　著・　

唐　靓　，罗　涛　，杨亚冬２　７张文元　（１．浙江省医学科学院保健食品研究所，杭州３１００１３；２．浙江省　医学科学院生物工程研究所，杭州３１００１３）　

【摘　要】　目的探讨简易、经济的Ⅳ型胶原酶消化法提取分离新生兔原代肝细胞及体外培养。方法采用０．１％　Ⅳ型胶原酶对新生免肝脏组织小块进行消化以提取兔原代肝细胞，体外进行单层培养，并对提取的兔肝细胞的细胞数量、　细胞活力和细胞增殖能力进行检测。结果提取的肝细胞主要呈类圆形，排列整齐，细胞透亮有光泽，立体感好．细胞界　限清晰。１　ｇ肝组织可分离１．１２ｘｌ０６个肝细胞，成活率为７７％。细胞增殖能力呈先升后降趋势，细胞生长曲线较符合原代细　胞生长的一般规律。结论该实验方法简单、易操作，无需特殊设备，适合一般实验室开展原代肝细胞的提取、分离与培养　【关键词】　原代肝细胞；ｌＶ型胶原酶；　细胞提取；　细胞培养；　新生兔　ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００９—５５１９．２０１７．１２．００２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００９—５５１９（２０１７）１２．１７６４－０２　

Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｒａｂｂｉｔ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ｓｉｍｐｌｅ　ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　Ｔａｎｇ　Ｌｉａｎｇｓ，Ｌｕｏ　Ｔａｏ　，　Ｙａｎｇ　Ｙａｄｏｎｇ２，Ｚｈａｎｇ　Ｗｅｎｙｕａｎ２△（　．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＨｅａｌｔｈ　Ｆｏｏｄ，ＺｈｅｊｉａｎｇＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆＭｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１００１３，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＺｈｅｊｉａｎｇＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆＭｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１００１３，Ｃｈｉｎａ）　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　ｆｒｏｍ　ｎｅｗｂｏｒｎ　ｒａｂｂｉｔ　ｂｙ　ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｅｃｏ—　ｎｏｍｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｒａｂｂｉｔ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｌｉｖｅｒ　ｔｉｓｓｕｅ　ｐｉｅｃｅｓ　ｏｆ　ｎｅｗ—　ｂｏｒｎ　ｒａｂｂｉｔ　ｂｙ　０．１％ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ｔｙｐｅ　ＩＶ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｗｅｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ　ｎｕｍｂｅｒ，ｃｅｌｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏ—　ｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｒｏｕｎｄ－ｌｉｋｅ，ｎｅａｔ　ｒｏｗｓ，ｂｒｉｇｈｔ　ｌｕｓｔｅｒ，ｗｉｔｈ　ｇｏｏｄ　ｓｔｅｒｅｏ　ｓｅｎｓｅ，ａｎｄ　ｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ．１．１２ｘ１０　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　１　ｇ　ｌｉｖｅｒ，ａｎｄ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　ｗａｓ　７７％．　Ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｔｅｎｄｅｎｃｙ　ｏｆ　ｒｉｓｉｎｇ　ｆｉｒｓｔ　ａｎｄ　ｆａｌｌｉｎｇ　ｌａｔｅｒ，ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｕｒｖｅ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ　ｔｏ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｒｕｌｅ　ｏｆ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｅｌｌｓ　ｇｒｏｗｔｈ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｓｉｍｐｌｅ，ｅａｓｙ　ｔｏ　ｏｐｅｒａｔｅ，ａｎｄ　ｎｏ　ｎｅｅｄ　ｓｐｅｃｉａｌ　ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，ｗｈｉｃｈ　ｉｓ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｔｏ　ｃａｒｒｙ　ｏｕｔ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ｐｒｉｍａｒｙ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ；Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ｔｙｐｅ　ＩＶ；Ｃｅｌｌ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；Ｃｅｌｌ　ｃｕｈｕｒｅ；Ｎｅｗｂｏｒｎ　ｒａｂｂｉｔ　

肝脏作为机体最大的解毒和营养代谢器官，肝细　胞是高度分化的细胞，具有丰富的酶系及多种特异性　功能，在多种生理病理过程中发挥重要作用，是研究药　物代谢的有效手段。肝细胞行使了肝脏的主要功能，原　代培养的肝细胞是目前药理学、毒理学、生物化学、细　胞生物学、生理学及药物研发等研究的主要对象，被称　为体外药物试验的“金标准”，从而避免采用大量动物　进行药理效应筛选。但原代肝细胞体外增殖能力差，不　易长时间保存或长期培养，其生物学性状易发生改变，　在一定程度上限制了肝细胞离体模型的广泛应用。目　前制备离体肝细胞常用的方法有非酶分离细胞法、离　体肝脏酶消化法及在体肝脏酶灌注法。这些分离培养　肝细胞的技术可以相互补充、灵活应用。目前，经典　的Ｓｅｇｌｅｎ两步胶原酶原位灌流法是国际上流行的肝细　胞分离方法　１。但该法操作技术及设备要求高、成本费　用高，一般实验室难以实施。本实验采用简便易行、经　济实用、不需要复杂设备的兔原代肝细胞分离培养方　法．有利于一般实验室提取原代肝细胞。　１材料与方法　１．１　材料及仪器　鼠尾Ｉ型胶原（杭州生友），低糖一　ＤＭＥＭ培养基（Ｇｉｂｃｏ），胎牛血清（ＦＢＳ），（杭州四季青），　Ⅳ型胶原酶（Ｓｉｇｍａ公司），２４、９６孑Ｌ塑料培养板　（Ｃｏｓｔａｒ公司）。ｃｏ：培养箱（Ｔｈｅｒｍｏ公司），倒置显微镜　（Ｏｌｙｍｐｕｓ公司，ＣＫＸ４１型），酶标仪（Ｔｈｅｒｍｏ公司，Ｍｕ１．　ｔｉｓｋａｎ　ＭＫ３型）。新西兰白兔，１日龄，体质量约１８０　ｇ，　雌雄不限，由浙江省实验动物中心提供，实验动物质量　合格证号：ＳＣＸＫ（浙）２００９．００３９号。　１．２方法　１．２．１离体肝脏胶原酶消化法提取原代肝细胞　处死　新生兔，无菌操作下剖腹取肝脏，冰浴条件下放置于装　有适量预冷的Ｄ．ｈａｎｋｓ培养皿，剥离肝被膜，并除去杂　质、血管、血污等，用眼科剪将组织剪成１　ｍｉｎｘ１　ｍｍｘｌ　ｍｍ　的细小碎块，使其成糊状。用Ｄ—ｈａｎｋｓ冲洗２次，加入５倍　于肝组织体积的０．１％１Ｖ型胶原酶，３７℃消化约４５　ｍｉｎ，　每隔１０～１５　ｍｉｎ吹打１次，待消化物成蓬松的絮状物后　加入含１０％ＦＢＳ的完全培养液。大部分组织块被消化　

基金项目：浙江省科技计划公益技术研究社会发展项目（２０１５Ｃ３３１０９）；浙江省科研院所专项基金资助项目（２０１５Ｆ１００１４，２０１６Ｆ１０００２）；浙江省医　药卫生科技计划项目（２０１６ＫＹＢ０７１，２０１７ＫＹ２９９）。　通信作者。Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｗｙ６１＠１６３．ｃｏｒｎ。　现代医药卫生２０１７年６月第３３卷第ｌ２期　Ｊ　Ｍｏｄ　Ｍｅｄ　Ｈｅａｌｔｈ，Ｊｕｎｅ　２０１７，Ｖｏ１．３３．Ｎｏ．１２　为细胞悬液，用吸管轻轻均匀吹打，得到肝细胞悬液，　分别经ｌ００、２００目钢筛网过滤，８００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ，　弃上清液．重悬，即可获得兔原代肝细胞。　１．２．２肝细胞成活率测定　将０．４％台盼蓝与肝细胞悬　液以１：９混合。通过台盼蓝拒染法检测细胞成活率，倒　置显微镜下进行活细胞计数，用未染色的活细胞占细　胞总数的百分比表示细胞成活率。　１．２．３肝细胞的原代培养及形态学观察　调整原代肝　细胞浓度为２ｘ１０ｓ　ｍＬ・细胞悬液，接种于预先铺有鼠尾　Ｉ型胶原的２４孔培养板，每孔接种１．５　ｍＬ，３７℃，５％　ＣＯ，饱和湿度条件下完全培养液静置培养。１　ｄ后首次　换液除去未贴壁细胞，以后隔天换液。倒置显微镜对肝　细胞进行形态学观察并拍照。　１．２．４细胞生长曲线检测　２４孔培养板上接种原代肝　细胞后分别培养ｌ、３、５、７、９、ｌｌ、１３、１５　ｄ，各时间点各　取６孔弃培养基，每孔加入１　ｍＬＤＭＥＭ培养液和７Ｏ　Ｌ　四唑盐（ＭＴｒ，５　ｍｇ／ｍＬ），继续培养４　ｈ后，吸弃上清液，　每孑Ｌ加入４２０　Ｌ二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）溶液，振荡ｌ０ｍｉｎ　后，每孑Ｌ吸取１５０　Ｌ至９６孑Ｌ板，以酶标仪检测４９０　ｎｌｎ　波长的光密度值（　），Ｏｎ，０得的光密度值与细胞增殖数　成正比。隔天测定至１５　ｄ。　２结　果　２．１　原代肝细胞形态学观察倒置显微镜下观察初分　离的新生兔原代肝细胞形态，可见细胞分布均匀，呈单　个游离态，透亮，类圆球形、三角形、圆形或扁平不规则　多角形，饱满，光泽与立体感好，细胞清晰（图１）。接种　４　ｈ后细胞开始贴壁。培养３　ｄ后，细胞拉平伸展，形状　不规则，体积增大，部分细胞呈多边形，细胞　五成群　连接生长（图２）。５　ｄ后，长出许多新生细胞，逐渐成铺　路石状成片生长（图３）；８　ｄ后，细胞开始有老化现象，　并有死细胞：ｎ现（图４）；ｌｌ～１５　ｄ，细胞出现黑色颗粒状　物质和空泡，逐渐死亡脱落（图５、６）。　图ｌ　初分离的新生兔原代肝　细胞（４００ｘ）　图２培养３　ｄ的兔原代肝细胞　（４００ｘ）　２．２肝细胞的产率及细胞成活率　用刚分离的原代肝　细胞做台盼蓝排斥试验，通过计数显示，ｌ　ｇ肝可分离　１．１２ｘ１０　个肝细胞，成活率为７７％。　２．３原代肝细胞生长曲线　原代肝细胞增殖能力呈先　升后降趋势。开始３　ｄ细胞生长相对较慢；接着３　５　ｄ　细胞生长相对较快；７￣９　ｄ之后，细胞活性降低；ｌ１～１５　ｄ，　细胞逐渐衰老死亡。较符合细胞生长的一般生物学规　律．见图７　图３培养５　ｄ的兔原代肝细胞　（４００ｘ）　图４培养８　ｄ的兔原代肝细胞　（４００ｘ）　图５培养ｌｌ　ｄ的兔原代肝细胞图６培养１５ｄ的兔原代肝细胞　（４００ｘ）　（４００ｘ）　Ｏ．７　０．６　Ｏ．５　０．４　０３　０．２　０．１　０　时问（（１）　图７新生兔原代肝细胞生长曲线　３讨　论　随着人类肝脏疾病的日趋增多．比如脂肪肝、肝硬　化．分离培养肝细胞也越来越重要。酶消化法是目前采　用极为广泛的方法。该法主要依靠各种酶的作用破坏　细胞间的结缔组织等之间的联系，加上外界条件适宜，　较组织块法更容易分离获得大量的单细胞。使用酶消　化法常用的酶有胰蛋白酶和胶原酶Ｉ　。胰蛋白酶既消化　细胞问质又消化细胞本身，操作简单，价格便宜。但胰　酶消化法的条件较难把握　。而胶原酶具有只消化细胞　问质而对肝细胞机械性损伤较小、消化力度较温和、操　作简单、分离效果好，也能较完整地保存膜蛋白　，细胞　维持肝特异性功能时问较长等优点ｌ　５ｌ，能在一定程度上　保证细胞活力１６１。　长期以来，国内外对肝细胞分离提取方法进行了大　量研究　Ｊ。早期主要用非酶法分离肝细胞，随后逐渐改　为酶消化法分离肝细胞，包括胶原酶消化法、胰蛋白酶　消化法。后来酶灌注法大大提高了肝细胞产量及活力。　经典的Ｓｅｇｌｅｎ两步胶原酶原位灌流法是目前国际上流　行的肝细胞分离方法。该法分离培养的肝细胞不仅数量　多、纯度高、活性好、形态好，而且还保留肝细胞的功能，　是分离培养原代肝细胞的经典方法ｌｌ。Ｉ。但该法需要特殊　的灌流装置，所需胶原酶量大，成本费用高。操作复杂，　技术要求高，所需时间长，原位消化时容易发生倒流，易　造成污染，使得一般实验室难以实施，　（下转第１７６８页）