膜片钳技术实现膜电位固定的关键 是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间 形成高阻（ 10ＧΩ ）密封,使电极尖端开 口处相接的细胞膜片与周围环境在电学 上隔离,并通过外加命令电压钳制膜电位。
由于玻璃微电极尖端管径很小,其下膜面 积仅约1μｍ2,离子通道数量很少,一般只有一 个或几个通道,经这一个或几个通道流出的离 子数量相对于整个细胞来讲很少 , 可以忽略 , 也就是说电极下的离子电流对整个细胞的静 息电位的影响可以忽略 , 那么 , 只要保持电极 内电位不变,则电极下的一小片细胞膜两侧的 电位差就不变,从而实现电位固定。
• 为研究化学门控性通道性质，我国学者秦 达 意 采 用 oil-gate concentration jump method ，配合膜片钳记录和分析离子通 道在各种化学条件下的开放与关闭以及激 活与失活的动态过程。
选择性（selectivity） 门控性（gating）
研究技术：
膜片钳技术和分子克隆技术
通道蛋白——离子通道
• 配体门控通道 阳离子通道：乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺受体 阴离子通道：甘氨酸和γ－氨基丁酸受体
乙酰胆碱受体
通道蛋白——离子通道
• 电压门控通道：钾、钠、钙离子通道
电压门控钾离子通道
通道蛋白——离子通道
磷脂双层的 屏蔽作用
Na-K 泵
离子的跨膜分布
[K+]o << [K+]i [Na+]o >> [Na+]i
离子通道
(ion channels)
离子通道是细胞膜上的一种特殊整合蛋白，对某 些离子（K+、Na+、Ca2+等）能选择通透，其功能是细 胞生物电活动的基础。
特性：通透性（permeation）
穿孔囊泡膜外面向外模式
(perforated vesicle outside-out mode)
• 穿孔膜片模式将电极向上提起，便在微电 极尖端处形成一个膜囊泡（膜内面向外膜 片断端融合封闭而成）。如果条件较好， 此膜囊泡内不仅有细胞质因子还可有线粒 体等细胞器存在。所以在有比较接近正常 的细胞内信号传递条件和代谢条件的基础 上，可能记录到膜外面向外模式的单一离 子通道。
Patch clamp-whole cell
细胞吸附膜片 (cell-attached patch mode)
• 一种将微电极吸附在细胞膜上对单离子通道电 流进行记录的模式。优点是不破坏细胞的完整 性, 内环境保持正常。缺点是不能人为直接地 控制细胞内环境条件，不能确切判明细胞内电 位。即使在浴液中加入刺激物质，也不能到达 与电极内液接触的膜片的细胞外面。但是，如 果膜片离子通道对浴液中的刺激物有反应，则 可以说明这种刺激物是经过某些 细胞内第二 信使的介导间接地起作用。
• 1992 年 ， 在 脑 片 膜 片 钳 技 术 上 ， 美 国 Ferster 实验室首次报道在在体猫的视皮层 用膜片钳全细胞记录研究了视刺激诱发的兴 奋性和抑制性突触后电位相互影响及节律性 膜电位的变化规律。
• 1993年，德国的Dodt和Sakmann合作，利 用红外电视显微镜监视，使得膜片钳记录 不但能够在神经元胞体及其树突上进行， 而且可同时在这两个不同的部位作膜片钳 记录。
• 环核苷酸门控通道 气味分子与G蛋白偶联型受体结合，激活腺苷酸环化酶， 产生cAMP，开启cAMP门控阳离子通道（cAMP-gated cation channel），引起钠离子内流，膜去极化，产生神 经冲动，最终形成嗅觉或味觉。 • 机械门控通道 一类是牵拉活化或失活的离子通道，另一类是剪切力敏 感的离子通道，前者几乎存在于所有的细胞膜，研究较多 的有血管内皮细胞、心肌细胞以及内耳中的毛细胞等，后 者仅发现于内皮细胞和心肌细胞 • 水通道 2003年诺贝尔化学奖： Pete Agre、 Roderick MacKinnon
•
History of Ion Channel Study 1955年，Hodgkin和Keens应用电压钳(Voltage
• • • •
clamp)在研究神经轴突膜对钾离子通透性时发现， 放射性钾跨轴突膜的运动很像是通过许多狭窄空洞 的运动，并提出了“通道”的概念。 1963年，描述电压门控动力学的Hodgkin-Huxley模 型（简称H-H模型），荣获诺贝尔医学/生理学奖。 1976年，Neher和Sakmann建立膜片钳(Patch clamp) 技术。 1983年10月，《Single-Channel Recording》一书 问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。 1991年， Neher和Sakmann的膜片钳技术荣获诺贝尔 医学/生理学奖。
• 1948年，Katz利用细胞内微电极技术记录到了 终板电位； 1969 年，又证实 N － M 接触后的 Ach以“量子式”释放，获1976年Nobel奖。 • 1976 年，德国的 Neher 和 Sakmann 发明 Patch Clamp （膜片钳）。并在蛙横纹肌终板部位记 录到乙酰胆碱引起的通道电流。 • 1980年，Sigworth、 Hamill、Neher等在记录 电极内施加负压吸引，得到了10~100 GΩ的高 阻封接(giga seal) ，大大降低记录噪声，实现 了单根电极既钳制膜电位又记录单通道电流。 获1991年Nobel奖。
cell electrophysiology & patch clamp techniques
1991 Nobel基金会的颁奖评语：
膜片钳技术点燃了细胞和分子水平 的生理学研究的革命之火，为细胞生理 学的研究带来了一场革命性的变化，它 和基因克隆技术并驾齐驱，给生命科学 研究带来了巨大的前进动力。
OUTLINE
1、细胞电生理学 2、膜片钳技术及其应用 3、离子通道药理学
电生理学研究简史：
• 二千年前，观察到电鳐鱼放电现象。 • 1825年，Nobili发明了电流计，用其证实 了肌肉有电流存在。 • 1912年，Bridge 确定了AP的“全或无” 现象。同年， Oxford 提出了突触的概念 及反射弧的生理学研究，获1932年Nobel 奖。
The Nobel Prize in Physiology or Medicine (1991)
Erwin Neher 1/2 of the prize Federal Republic of Germany Max-Planck-Institut fü r Biophysikalische Chemie, Goettingen, Federal Republic of Germany
组织切片膜片钳技术（Slice patch）
• 过去认为，膜片钳只能在培养细胞或酶 解的细胞上进行，这样得到的细胞膜表 面比较光滑，才能够形成高阻封接，但 缺点是组织的正常三维结构被破坏，并 且对神经中枢内突触特有的传递机能的 研究无法展开。于是，一些学者建立了 组织切片膜片钳技术（ Slice patch ）， 就能在哺乳动物脑片制备上做全细胞记 录。
OUTLINE
1、细胞电生理学 2、膜片钳技术及其应用
3、离子通道药理学
细胞电生理学
Electrophysiology
离子、离子通道
细胞兴奋
生物电信号
测量
细胞生理学
细胞生理学：揭示细胞的生理过程，用电生 理方法记录生物电活动
膜的“流动镶嵌模型”
细胞膜和离子学说建立（Hodgkin，et al . 1946年 ）
外面向外膜片 (outside-out patch)
• 在全细胞模式上将微管电极向上提起,可得 到切割分离的膜片，断端游离部分自行融 合成脂质双层,此时高阻封接仍然存在。而 膜外侧面接触浴槽液。用这种模式，可自 由改变细胞外液的情况下，记录单一离子 通道的电流活动。
开放细胞吸附膜内面向外模式
（open cell-attached inside-out mode）
• 1937 年， Hodgkin 和 Huxley 在枪乌贼巨大神经 轴 突 细 胞 内 实 现 细 胞 内 电 记 录 ， 获 1963 年 Nobel奖。 • 1946 年，凌宁和 Gerard 创造拉制出尖端直径小 于 1μm 的玻璃微电极，并记录了骨骼肌的电活 动。玻璃微电极的应用使的电生理研究进行了 革命性的变化。 • Voltage clamp （ 电 压 钳 技 术 ） 由 Cole 和 Marmont 发明，并很快由 Hodgkin 和 Huxley 完 善，真正开始了定量研究，建立了 H － H 模型 （膜离子学说),是近代兴奋学说的基石。
• 将细胞吸附式的膜片以外的某部位的胞 膜进行机械地破坏，经破坏孔调控细胞 内液，并在细胞吸附状态下进行内面向 外的单一离子通道记录。这种方法的细 胞体积越大，破坏部位离被吸附膜片越 远或破坏孔越小，都可导致细胞因子外 流变慢。
穿孔膜片模式 （perforated patch mode）
• 为克服全细胞模式的胞质渗漏问题， Horn 和 Marty 将与离子亲和的制霉菌素 （或二性霉素Ｂ）经膜片微电极灌流到 含类甾醇的细胞膜片上，形成只允许一 价离子通过的孔，用此法在膜片上做很 多导电性孔道借此对全细胞膜电流进行 记录。因为此模式的胞质渗漏极为缓慢， 局部串联阻抗较全细胞模式高，所以钳 制速度很慢，故也称为缓慢全细胞模式。
内面向外膜片 (inside-out patch)
• 在细胞吸附模式高阻封接形成后 ,将微管 电极提起 ,使吸附的膜片从胞体上被切割 下来，就得到“内面向外”膜片。此种 模式，可直接且自由地经浴液介导而调 控细胞内液的条件，并可在和细胞活动 无关的形式下观察到单一离子通道的活 动。但是，由于胞质渗漏，可能丢失某 种通道调控因子，离子通道活动出现rundown （或run-up）现象。
b. 1942
膜片钳技术
• 膜片钳技术：从一小片(约几平方微米) 膜 获取电子学方面信息的技术，即保持跨膜 电压恒定——电压钳位，从而测量通过膜 离子电流大小的技术。通过研究离子通道 的离子流， 从而了解离子运输、信号传递 等信息。