NY/T 536—2002 前言 鸡伤寒和鸡白痢(fowl typhoid and pullorum disease)是由鸡白痢沙门氏菌(salmonella pullorum)和鸡伤寒沙门氏菌(salmonella gallinarum)引起的各种日龄鸡和火鸡的传染病，以急性败血性经过或以慢性隐性感染为特征。本病呈世界性分布，所有养鸡的国家和地区都有发生。雏鸡发生本病时，发病率和死亡率均较高，严重影响雏鸡成活率；青年鸡发病后，死亡率可达10%～20%，病程可达20天～30天，鸡只生长发育受阻；成年鸡感染本病多为慢性或隐性经过，不表现明显的症状，但可长期带菌，成为本病的主要传染源，产蛋鸡可经蛋垂直传播，因此种鸡感染后可造成更大范围的传播，集约化养鸡场一旦发生本病会造成巨大的经济损失。
世界动物卫生组织[World Organization for Animal Health(英)，Office Intentional des Epizootic(法)，OIE]将鸡伤寒和鸡白痢列为B类疾病，并规定了诊断标准和相应生物制品(多价抗原)的制造、标定和使用的国际标准，指定了专业实验室向全世界提供鸡白痢阳性血清标准型(S)和变异型(V)国际标准品。我国农业部也将其列为二类疫病。
本标准中的病原分离和鉴定及全血平板凝集试验是参照OIE《诊断试验和疫苗标准手册》(2000版)(Manual of Standards for Diagnostic Tests And Vaccines，2000)等相关标准性文件制定的。
本标准中的附录A为规范性附录。 本标准由农业部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:中国兽医药品监察所。 本标准起草人:夏业才、张学琴、康凯、姚文生。 1范围 本标准规定了鸡伤寒和鸡白痢病原分离和鉴定及全血平板凝集试验技术。 本标准所规定的病原分离鉴定适用于各种日龄鸡的鸡伤寒和鸡白痢的诊断；全血平板凝集试验适用于成年鸡的鸡伤寒和鸡白痢的诊断，可用于诊断、流行病学调查和无本病健康鸡群监测。 2病原分离和鉴定 2.1材料准备 2.1.1培养基 鉴别培养基:SS琼脂、麦康凯琼脂。 增菌培养基:亚晒酸盐煌绿增菌培养基、四硫磺酸钠煌绿增菌培养基、三糖铁琼脂和赖氨酸铁培养基。
以上各培养基配制方法见附录A。 2.1.2沙门氏菌属诊断血清 A-F多价O血清、O9因子血清、O12因子血清、H-a因子血清、H-d因子血清、H-g.m因子血清和H-g.p因子血清。
2.2采集病料 可采集被检鸡的肝、脾、卵巢、输卵管等脏器，无菌取每种组织适量，研碎后进行培养。 2.3分离培养 将研碎的病料分别接种亚晒酸盐煌绿增菌培养基(见第A.3章)或四硫磺酸钠煌绿增菌培养基(见第A.4章)和SS琼脂(见第A.l章)平皿或麦康凯琼脂(见第A.2章)平皿，37℃培养24h～48h，在麦康凯或SS琼脂平皿上若出现细小无色透明、圆形的光滑菌落，判为可疑菌落。若在鉴别培养基上无可疑菌落出现时，应从增菌培养基中取菌液在鉴别培养基上划线分离，37℃培养24h～48h，若有可疑菌落出现，则进一步做鉴定。
2.4病原鉴定 2.4.1生化试验和运动性检查:将可疑菌落穿刺接种三糖铁琼脂(见第A.5章)斜面和赖氨酸铁琼脂(见第A.6章)斜面，并在斜面上划线，同时接种半固体培养基，37℃培养24h后观察，若无运动性，并且在三糖铁琼脂培养基或在赖氨酸铁琼脂培养基上出现阳性反应时，则进一步作血清学鉴定。
2.4.2血清学鉴定:对初步判为沙门氏菌的培养物作血清型鉴定，取可疑培养物接种三糖铁琼脂斜面，37℃培养18h～24h，先用A-F多价O血清与培养物作平板凝集反应，若呈阳性反应，再分别用O9、O12、H-a、H-d、H-g.m和H-g.p单价因子血清作平板凝集反应，如果培养物与O9、O12因子血清呈阳性反应，而与H-a、H-d、H-g.m和H-g.p因子血清呈阴性反应时，则鉴定为鸡白痢沙门氏菌或鸡沙门氏菌。
2.4.3用接种环取两环因子血清于洁净玻璃板上，然后用接种环取少量被检菌苔与血清混匀，轻轻摇动玻板，于l min内呈明显凝集反应者为阳性，不出现凝集反应者为阴性，试验时设生理盐水作对照应无凝集反应出现。
3全血平板凝集试验 3.1材料准备 3.1.1鸡伤寒和鸡白痢多价染色平板抗原、强阳性血清(500IU/mL)、弱阳性血清(10IU/mL)、阴性血清。
3.1.2玻璃板、吸管、金属丝环(内径7.5mm～8.0mm)、反应盒、酒精灯、针头、消毒盘和酒精棉等。
3.2操作 在20℃～25℃环境条件下，用定量滴管或吸管吸取抗原，垂直滴于玻璃板上1滴(相当于0.05mL)，然后用针头刺破鸡的翅静脉或冠尖取血0.05mL(相当于内径7.5mm～8.omm金属丝环的两满环血液)，与抗原充分混合均匀，并使其散开至直径为2cm，不断摇动玻璃板，计时判定结果，同时设强阳性血清、弱阳性血清、阴性血清对照。
3.3结果判定 3.3.1凝集反应判定标准如下: a)100%凝集(#):紫色凝集块大而明显，混合液稍浑浊； b)75%凝集(+++):紫色凝集块较明显，但混合液有轻度浑浊； c)50%凝集(++):出现明显的紫色凝集颗粒，但混合液较为浑浊； d)25%凝集(+):仅出现少量的细小颗粒，而混合液浑浊； e)0%调集(－):无凝集颗粒出现，混合液浑浊。 3.3.2在2min内，抗原与强阳性血清应呈100%凝集(#)，弱阳性血清应呈50%凝集(++)，阴性血清不凝集(－)，判试验有效。 3.3.3在2min内，被检全血与抗原出现50%(++)以上凝集者为阳性，不发生凝集则为阴性，介于两者之间为可疑反应，将可疑鸡隔离饲养1个月后，再作检疫，若仍为可疑反应，按阳性反应判定。
附录A (规范性附录) 培养基的制备 A.1 SS琼脂 A.1.1成分 牛肉浸粉 5g 蛋白胨 5g 胆盐 2.5g 蛋白胨 10g 乳糖 10g 硫代硫酸钠 8.5g 柠檬酸钠 8.5g 柠檬酸铁 1.0g 中性红(1%) 2.0mL 煌绿(0.01%) 3.3mL 琼脂粉 13g 蒸镏水 1000mL A.1.2制法 A.1.2.1将上述材料(除中性红和煌绿溶液外)混合，加热溶解。 A.1.2.2待琼脂完全溶化后，以氢氧化钠溶液调整pH至7.1～7.2。 A.1.2.3将中性红和煌绿溶液加入，混合均匀后，分装于容器中。 A.1.2.4以103.7kPa灭菌20min～30min。 A.1.3用途 供鉴定沙门氏菌用。 A.2麦康凯琼脂 A.2.1成分 蛋白胨 20g 乳糖 10g 氯化钠 5g 胆盐 5g 中性红水溶液(1%) 0.5mL 琼脂粉 13g 蒸镏水 1000mL A.2.2制法 A.2.2.1除中性红溶液外，其他成分混合，加热溶解。 A.2.2.2待琼脂完全溶化后，以氢氧化钠(NaOH)溶液调整pH至7.4。 A.2.2.3加入中性红水溶液，混合均匀后，分装于容器中。 A.2.2.4以103.7kPa灭菌20 min～30min。 A.2.3用途 供分离培养沙门氏菌、大肠杆菌等肠道菌用。 A.3亚砸酸盐煌绿增菌培养基(SB培养基) A.3.1成分 酵母浸出粉 5g 蛋白胨 10g 甘露醇 5g 牛磺胆酸钠 1.0g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.65g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.02g 亚硒酸氢钠 4g 新鲜0.1%煌绿水溶液 5mL 蒸馏水 1000mL A.3.2制法 A.3.2.1除亚硝酸氢钠和煌绿溶液外，其他成分混合于800mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，冷至60℃以下，待用。
A.3.2.2将亚硒酸氢钠加入，再加20mL蒸馏水加热煮沸溶解，冷至60℃以下，待用。 A.3.2.3将煌绿溶液加入，调整pH至6.9～7.1。 A.3.3用途 为沙门氏菌选择性增菌培养基。 A.4四硫磺酸钠煌绿增菌培养基(TTB培养基) A.4.1成分 蛋白胨或多价蛋白胨 5g 胆盐 1.0g 碳酸钙 10g 硫代硫酸钠 30g 0.1%煌绿溶液 10mL 碘溶液 20mL 蒸馏水 1000mL A.4.2制法 A.4.2.1除碘溶液和煌绿溶液外，其他成分混合与水中，加热溶解，分装于中号试管或玻瓶，试管每支10mL，玻瓶每瓶100mL。在分装时不断振摇，使碳酸钙均匀地分装于试管或玻瓶。经112 kPa 15min高压灭菌，备用。
A.4.2.2临用时，每10 mL或100mL上述混合溶液中，加入碘溶液0.2mL或2mL和0.1%煌绿溶液0.1mL或1mL(碘溶液由碘片6g、碘化钾5g，加20mL灭菌的蒸馏水配制而成)。
A.4.3用途 供沙门氏菌增菌培养用。 A.5三糖铁培养基 A.5.1成分 牛肉浸粉 5g 酵母浸粉 3g 酵母浸出粉 2.5g 氯化钠 5g 蛋白胨 7.5g 蛋白胨 7.5g 琼脂粉 15g 乳糖 10g 蔗糖 10g 葡萄糖 1.0g 硫酸亚铁 0.2g 硫代硫酸钠 1.8g 1%酚红 0.2mL 蒸馏水 1000mL A.5.2制法 A.5.21除糖类和酚红外，其他成分混合于水中，加热溶解。 A.5.2.2调整pH至7.4～7.6，再加糖类及指示剂，混匀。 A.5.2.3分装于试管中。 A.5.2.4以103.7kPa灭菌20min～30min，趁热取出，制成斜面，斜面及底层应各占二分之一为宜。
A.5.3用途 供鉴别肠道菌用。 A.6赖氨酸铁琼脂 A.6.1成分 蛋白胨 5g 酵母浸粉 3g 柠檬酸铵铁 0.5g