第２２卷第９期 ２００８年９月 化工时刊
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔ￣Ｔｉｍｅｓ Ｖ０ｆ．２２，Ｎｏ．９
Ｓｅｐ．９．２００８
Ｏｔ‘＿＿‘ 葡萄糖苷酶的研究进展 陈丽华 潘自红 马 威 （平顶山学院化学化工学院，河南平顶山４６７０００）
摘要综述了Ｏｔ一葡萄糖苷酶的主要性质以及当前已知的该酶的提取、纯化及活性测定方法，以便对其今后的应用 研究起到导向作用。 关键词ａ一葡萄糖苷酶性质提取纯化
Ａ Ｓｃｒｅｅｎ ｏｆ 一Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ
Ｃｈｅｎ Ｌｉｈｕａ Ｐａｎ Ｚｉｈｏｎｇ Ｍａ Ｗｅｉ （Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐｉｎｇｄｉｎｇｓｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｎａｎ Ｐｉｎｇｄｉｎｇｓｈａｎ ４７６０００）
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｏｔ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｗｅｒｅ ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｆｒｏｍ ｆｏｕｒ ａｓｐｅｃｔｓ，ｃｈａｒａｃｔｅｓ，ｅｘｔｒａｃｔｅｄ，ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｉｓｃｕｓｓ ｔｈｅ ｆｏｃｕｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｒｅｎｄ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｉｓ ｆｉｅｌｄ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ ｐｕｒｐｏｓｅ ｗａｓ ｔｏ ｇｉｖｅ ｓｏｍｅ ｏｒｉｅｎｔｅｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ —ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔ ｐｕｒｉｆｙ
ｄ一葡萄糖苷酶（ —ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，Ｅ．３．１．２０）又 叫仅一Ｄ一葡萄糖苷水解酶，是一类能够从含有 一 糖苷键底物的非还原端催化水解仅一葡萄糖基酶的 物质总称。它可从低聚糖类底物的非还原末端切开 １，４糖苷键，释放出葡萄糖，或将游离出的葡萄糖 残基转移到另一糖类底物形成 一１，６糖苷键，从而 得到非发酵性的低聚异麦芽糖或糖酯、糖肽等 １ Ｊ。 它广泛存在于自然界的所有生物体内，种类繁多，性 质各异，自从筛选出Ｑ一葡萄糖苷酶生产菌种，并得 以工业化生产酶制剂以来，它已应用于生产具有双歧 杆菌增殖因子和抗龋因子双重功能的低聚异麦芽糖 等领域，倍受国内外食品工业界的重视 Ｊ。另外在 机体的许多代谢尤其是糖代谢过程中它起着关键作 用 Ｊ，所以它也是现今开发降 一葡萄糖苷酶抑制剂 类降糖药物的仿生实验中必不可少的原料之一，但国 内均来自进口，为此，充分探讨 一葡萄糖苷酶性质， 以便从天然生物体中提取和纯化仅一葡萄糖苷酶，对 降低实验成本，提高研究水平具有重要意义。 口仅一葡萄糖苷酶的性质 １．１相对分子质量 葡萄糖苷酶的相对分子质量一般在４０ ０００ １５０ ０００之间 Ｊ。不同来源的０【一葡萄糖苷酶的 相对分子质量差异很大，日本天野制药株式会社生产 的黑曲霉０【一葡萄糖苷酶（ＴＧＬＡ）的相对分子质量为 １２５ ０００－５ ；而藤井聪等 从中国华南地区的粉葛根 中分离出一株丝状真菌的ｄ～葡萄糖苷酶，其相对分 子质量经凝胶色谱法测定为５７ ０００，十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶法（ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）测定为６０ ０００。 可见不同来源的ｄ一葡萄糖苷酶的相对分子质量差
收稿日期：２００８—０４—１４ 基金项目：平顶山学院高层次人才科研启动经费资助 作者简介：陈丽华（１９７９～），女，讲师，研究领域为天然产物化学与食品保健功能因子Ｅ—ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｌｉｈｕａ２０４４２７＠１６３．ｃｏｎ
３６— 陈丽华等ａ一葡萄糖苷酶的研究进展 ２００８．Ｖｏ１．２２，Ｎｏ．９■蟹圃 异很大。岳振峰等表明即使是同一菌属的不同菌株 或同一植物组织中的不同ｏｒ．一葡萄糖苷酶的相对分 子质量也存在显著差异 。 １．２等电点（ｐＩ）、最适ｐＨ值及ｐＨ值稳定性 目前已经发现的所有ｏｒ．一葡萄糖苷酶的ｐＩ都在 酸性范围，并且变化不大，一般在３．０～５．０之间，但 最适ｐＨ值可以超过７．０¨－３］。枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌ－ ｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）２５Ｓ和Ｂａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｌｙｔｉｃ￣Ｃ２的ｐＩ均为 ４．８５，最适ｐＨ值分别为７．５和７．０ ．Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ的２种 一葡萄糖苷酶的ｐ１分别为３．９ 和４．２ｌ８ ；黑曲霉仅一葡萄糖苷酶的最适ｐＨ值多分 布在３．５—６．５［３】。岳振峰等 认为一般ｏｒ．一葡萄糖
苷酶的稳定ｐＨ值范围超过２个ｐＨ值单位。 １．３最适温度及热稳定性 多数Ｏｒ．一葡萄糖苷酶具有较高的热稳定性和最 适温度，这有利于其工业化应用 Ｊ。ＴＧＬＡ在２０￣Ｃ 以下贮存稳定，最适温度为５０℃。提取的真菌Ｏｔ一葡 萄糖苷酶在ｌ５—３０℃稳定，最适温度也为５０￣Ｃ＿６ Ｊ。 从一株嗜热性古细菌中分离的仅一葡萄糖苷酶的最 适温度在７５￣Ｃ左右；在缓冲溶液中９８℃下半衰期达 ３５ ｍｉｎ，若添加１％二硫苏糖醇（ＤＤＴ）和１％牛血清 白蛋白（Ｂｓａ），其半衰期可提高到２１５ ｍｉｎ；而采用特 殊的化学修饰和固定化技术可使其稳定温度提高到 １３０℃ 。仅一葡萄糖苷酶的热稳定性可能与其氨基 酸组成有关，并随酶分子中疏水氨基酸成分增加而提 高。对枯草芽孢杆菌２５Ｓ、Ｂａｅｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｃ２以及 枯草芽孢杆菌Ｈ２１７中Ｏｔ一葡萄糖苷酶氨基酸组成的 研究表明，酶分子中甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸及亮氨酸 等疏水性氨基酸数量的增加有助于提高其热稳定性， 这可能是由于疏水相互作用的加强导致酶分子的立 体结构更加紧密的缘故¨ “］。 １．４底物专一性 岳振峰等 表明 一葡萄糖苷酶属于键专一性 酶，它可专一性地切开糖类底物分子中的ｄ一１，４糖 苷键，个别种类的ｄ一葡萄糖苷酶也可以作用于蔗糖 的 一１，２糖苷键。因此，一般来说，仅一葡萄糖苷酶 对底物要求不甚严格，具有广泛的底物专一性 ］。 有研究表明，ＴＧＬＡ可作用于麦芽二一八糖、苯基Ｏｔ一 葡萄糖苷、苯基ＯＬ一麦芽糖苷、ｄ一葡萄糖苷、海藻糖、 黑曲糖、环状糊精、可溶性淀粉及直链淀粉等，其最适 作用底物为麦芽三糖、麦芽四糖和苯基ＯＬ一麦芽糖 苷¨ ；蜜蜂 一葡萄糖苷酶Ⅱ可作用于麦芽二～七 糖、海藻糖黑曲糖、异麦芽糖、蔗糖、松二糖、苯基 一 葡萄糖苷、对硝基苯基 一葡萄糖苷、苯基仪一麦芽 糖苷、环状糊精和可溶性淀粉等，其最适作用底物为 苯基 一葡萄糖苷和对硝基苯基Ｏｔ一葡萄糖苷 。 岳振峰等［４】表明 一葡萄糖苷酶底物专一性的 差异取决于其活性中心结合部位的氨基酸构成。对 Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＳＡＭ１６０６ ０Ｌ一葡萄糖苷酶的底物专一性进 行了研究为研究决定该酶具有广泛底物专一性的关 键氨基酸残基，对ＳＡＭ１６０６ 一葡萄糖苷酶的５个氨 基酸残基进行了定向诱变，结果表明，所有诱变株对 麦芽糖、异麦芽糖和蔗糖的Ｋｍ值无显著变化，而含 有Ｇｌｙ２７３Ｐｒｏ残基的诱变株对海藻糖的Ｋｍ值明显增 加，说明对海藻糖的亲和性主要由Ｇｌｙ２７３Ｐｒｏ残基控 制，而进一步的研究表明Ｔｈｒ３４２Ａｓｎ残基可提高其控 制效果 。
仅一葡萄糖苷酶的提取 岳振峰等＿４ 研究的ＰＡＯ抽提方法：取洗净后的 满江红按每ｇ鲜重加３ ｍＬ抽提液的比例加不同的抽 提液（预冷至４￣Ｃ），冰浴中研磨成匀浆，４层纱布过 滤，滤液离心２０ ｍｉｎ（４℃，１８ ０００ ｒ／ｍｉｎ）。上清液即 为该酶液，置冰浴中备用。 葡萄糖苷酶也可以采用酶的常用的分离提 取方法，如：醇法 ”】、水一醇法 ¨］、醇吸附树脂法 引、 醇提一醚（酮）沉淀法¨ 、透析法ⅢＪ、氧化镁吸附 法 引、葡聚糖凝胶法 ］、大孔吸附树脂法 驯、硅胶柱 层析法 等。
仅一葡萄糖苷酶的纯化 纯化酶的方法很多，最常用的有硫酸铵沉淀、离 子交换层析、分子筛层析和亲和层析等 Ｊ。目前，国 内对 一葡萄糖苷酶的纯化研究大多集中于硫酸铵 分级沉淀的报道 Ｊ，冷丙酮沉淀纯化法：在冰浴条件 下向酶抽提液中边搅拌边加入不同体积比的冷丙酮 （一ｌ５℃），其余做法同硫酸铵沉淀法 。 硫酸铵沉淀法是许多酶初纯阶段经常采用的步 骤＿２引。这是因为硫酸铵沉淀酶对活性损伤少，沉淀 可长时间保存；同时，各种蛋白结构不同，硫酸铵与之 作用的起始质量浓度沉淀和完全沉淀浓度也各不相 同，从而可对粗提液中的酶进行预提纯，除去大部分
３７— 墨圆２００８．Ｖｏ１．２２，Ｎｏ．９ 论文综述《Ｒｅｖｉｅｗｓ｝ 杂蛋白。用该法纯化操作简便，成本低廉，但是分辨 力差，纯化倍数不高，且酶中混杂大量盐分，进一步纯 化时需脱盐操作。丙酮沉淀法具有高分辨率的特点， 是酶蛋白初步纯化的另一常用方法。前人研究表明， 采用１．０—１．５倍体积比的冷丙酮直接沉淀粗酶液效果 更理想，且除去大量的杂蛋白和色素物质，特别是丙酮 与酶抽提液体积比为１：２时纯化倍数与产率都较 高 。由此可以看出用硫酸铵（４０％一６０％）分级盐 析沉淀法与丙酮法相结合的方法是更利于酶的纯化。
蛋 一 测定 游离酶活力测定：酶活力单位定义为：在ｐＨ值 为５．０、４０℃下，酶作用于甲基一 —Ｄ一葡萄糖苷每 ｈ生成１ ｇ葡萄糖的酶量为１个活力单位。固定化 酶活力的测定方法基本与游离酶相同，只是反应过程 中始终保持搅拌 。覃广泉等 研究的ＰＡＯ的 测定方法：反应混和物于３０℃水浴反应２ ｍｉｎ后测 定４７０ ｎｍ波长处光密度值变化，以每ｍｉｎ改变０．０１ 光密度单位的酶量为１个酶活力单位（Ｕ）。马庆一 等 钊以麦芽糖为底物测活力，在纸上作微量葡萄糖 分析，以达到测定 一葡萄糖苷酶活性的目的。
从酶的研究历史来看，第一代的研究是以阐明各 种酶的一级结构和高级结构为标志；第二代的研究是 以阐明酶的催化机制和限定分解机制为标志；第三代 的研究酶及抑制剂对各种疾病病因加以阐明并提出 治疗方案。与国外相比，我们研究还处于起步阶段， 主要精力放在仅一葡萄糖苷酶生产菌种的筛选方面， 关于其性质、化学结构、催化机制等方面的报道几乎 空白。而探讨更有效Ｏｔ一葡萄糖苷酶的抽提、纯化方 法，不仅可弥补大量实验中该酶依赖进口所带来的不 便，还填补国内研究领域空白，也为进一步研究酶的 性质奠定了基础。
［２］ ［３］
参考文献 倪星忠．临床生化酶试剂方法［Ｍ］．上海：华东师范大学 出版社，１９９３，１８２—１８８ 何生根，黄学林，傅家瑞．部分植物中的多胺氧化酶活性 ［Ｊ］．植物生理学通讯，１９９７，３３（６）４：３２～４３３ 张龙祥．生化实验方法和技术［Ｍ］．北京：高等教育出版
社，１９８５ ［４］ 岳振峰，陈小霞，彭志英，等．功能性低聚糖分离纯化方 法概述［Ｊ］．食品科学，２０００，２６（３）：６３—６７ ［５］ 柳畅先，吴士筠．酵母醇脱氢酶的分离纯化［Ｊ］．中南民 族大学学报（自然科学版），２００３，２２（２）：１１—１２ ［６］ 赵德臻，陈兰英，余曙华．人肌型和脑型肌酸激酶的提纯 与性质的比较［Ｊ］．生物化学与生物物理学报，１９８１，１３ （１）：１７～２０ ［７］ 岳振峰，陈小霞，彭志英．Ｏｒ．一葡萄糖苷酶研究现状及进 展［Ｊ］．食品与发酵工业，２０００，２６（３）：６３～６７ ［８］ 高小平，等．中药提取物中 一葡萄糖苷酶抑制剂的筛 选［Ｊ］．天然产物研究与开发，２００３，１５（６）：３６—３８ ［９］Ｐｉｅｒｒｅ Ｃ Ｒｏｌ ａｎｄ Ｒ Ｔｒｅｍｂｌａｙ．Ｐ—Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏ ｌ— —ｇｌｕｃｏ— ｐｙｒａｍｏｓｉｄｅ ａｓ ｓｕｂｓｔｒａｃｔ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｈａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｍｅｎ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｃｉｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７８，２４２：２—１１ ［１Ｏ］ 陈英杰，张绍林，王品星．人参叶中微量新皂的分离鉴 定［Ｊ］．药学学报，１９９０，２５（５）：３７９～３８１ ［１１］ Ｋｉｍ Ｓｉ，Ｐａｒｋ Ｊ Ｈ，Ｒｙｕ Ｊ Ｈ．ＧｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅＲｇｓ，ａｇｅｎｕｉｎｅ ｄａｍｍａｒａｎｅ ｇｌｙｅｉｓｉｄ ｆｒｏｍ ｋｏｒｅａｎｒｅ ｄｇｉｎｓｅｎｇ［Ｊ］．Ａｒｃｈ． Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１９９６，１９（６）：５５１～５５３ ［１２］Ｂａｅｋ Ｎ Ｉ，Ｋｉｍ Ｄ Ｓ，Ｌｅｅ Ｙ Ｈ．ＧｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅＲＭ，ａｇｅｎｕｉｎｅ－ ｄａｍｍａｒａｎｅｇｌｙｅｏｓｉｄｅ ｆｒｏｍ ｋｏｒｅａｎｒｅｄｇｉｎｓｅｎｇ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ．，１９９６，６２（１）：８６—８７ ［１３］Ｍｏｒｉｔａ Ｔ，Ｋａｓａｉ Ｒ，Ｔａｎａｋａ ０．Ｓａｐｏｎｉｎｓ ｏｆ Ｚｕ—ｔｚｉｓｅｎｇ， ｒｈｉｚｏｍｅｓ ｏｆ ｐａｎａｘｊａｐ ｏｎｉｅｕｓＣ． Ａ． ｍｅｙｅｒｖａｒ． ｍａｊｏｒ （Ｂｕｒｋ）Ｃ．Ｙ．ＷｕｅｔＫ．Ｍ．Ｆｅｎｇ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ‘Ｙｕｎｎａｎ， ｃｌｌｉｎａ［Ｊ］．Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌ１．，１９８２，３０（１２）：４３４１— ４３４５ ［１４］ 吕永俊，徐绥绪．人参皂甙的化学研究方法［Ｊ］．沈阳 药学院学报，１９８５，２（１）：６３～１５０ ［１５］王乃利，徐绥绪，李冰．人参化学成分的研究——大孔 吸附树脂比色法测定人参皂甙［Ｊ］．沈阳药学院学报， １９８５，２（４）：２８８～２９１ ［１６］徐任生主编．天然产物化学［Ｍ］．北京：科学出版社，