促甲状腺激素(TSH)检测方法小析
摘 要:促甲状腺激素(thyroid stimulating
hormone,thyrotropin,tsh)由脑垂体前叶的嗜碱性细胞分泌,以游离的形式存在于血液中,含量很低,性质稳定的一种糖蛋白激素。主要生理功能是促进甲状腺的发育和分泌,从而影响全身的代谢。鉴于tsh检测结果的重要临床意义,其检测方法有很多,主要有放射免疫分析,免疫放射分析等。随着生物、化学以及材料等学科的发展,科学家们正在努力寻求更准确、更便捷、低成本的检测方法,为内分泌疾病的临床诊断提供快速、准确的数据。
关键词:促甲状腺激素(thyroid stimulating
hormone,thyrotropin,tsh) 放射免疫分析 tsh检测方法
中图分类号:r446 文献标识码:a 文章编号:1674-098x(2012)07(a)-0004-03
促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,thyrotropin,tsh)由脑垂体前叶的嗜碱性细胞分泌,以游离的形式存在于血液中,含量很低,性质稳定的一种糖蛋白激素。其相对分子量为25～28kda。与促卵泡刺激激素(follicle stimulating hormone,fsh)、促黄体生成素(luteinizing hormone,lh)以及人绒毛膜促性腺激素(human
chorionic gonadotropin,hcg)一样均为异源二聚体糖蛋白激素,由非特异的α亚基和特异性β亚基以非共价键联结而成[1,2]。主要生理功能是促进甲状腺的发育和分泌,从而影响全身的代谢。
tsh是受下丘脑-脑垂体-甲状腺这一条轴线控制的,下丘脑是最高层,分泌的促甲状腺激素释放激素(thyroid-stimulating
hormone releasing hormone,trh)而甲状腺是最底层,释放的是甲状腺素,脑垂体前叶居于中间,上受到下丘脑分泌的trh调控,下有受到甲状腺分泌的甲状腺激素(t3,t4)的反馈调节。当甲状腺功能发生改变时,tsh水平呈现明显的波动。甲状腺机能低下者多表现为血液中的tsh水平增高,甲状腺功能亢进以及垂体机能减退者多表现为tsh的降低,同时tsh水平的高低也是检测新生儿先天性甲状腺机能减退的指标。1995年,美国国家临床生物化学家协会 (us
national association of clinical biochemists,nacb)提出了将tsh 作为甲状腺功能的一线测试项目(first-line test)。即在甲状腺功能检测中,先考虑tsh的测试结果,再结合其余甲状腺激素的测试结果进行疾病的诊断,并且通过tsh的精确测定能排除众多非甲状腺疾病的干扰。
鉴于tsh检测结果的重要临床意义,其检测方法有很多,主要有放射免疫分析,免疫放射分析,酶联免疫吸附,时间分辨免疫荧光测定技术,电化学发光检测,化学发光免疫分析以及一些生物发光检测[3,4]、颗粒凝集检测法[5,6]等。
放射免疫分析法(radioimmunoassay,ria)是促甲状腺激素的较早期检测方法。该法使用竞争反应模式,标记tsh抗原与样本或标准品内抗原竞争结合抗体,实现定量。放射免疫分析灵敏度不够,无法区分部分正常人的tsh水平,且操作时间很长,干扰因素多、放射性元素的抗原标记物稳定性欠佳,故其应用受到一定的限制[7]。免疫放射分析(immunoradiom-eric assay,irma)在ria基础上进行改进,该方法使用过量标记抗体,采用双抗体夹心的免疫反应模式。一方面保证抗体与待测标本中的抗原充分反应,缩短反应时间,一定程度上提高了灵敏度;另一方面,标记的是免疫球蛋白,标记试剂相对稳定。但其仍无法避免方法的放射性元素的污染[8～12]。
继放射免疫分析后出现的tsh酶联免疫吸附法(immunoenzymetric assay,iema)或称之为酶联免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,elisa)以酶作为标记物,使用非竞争反应模式,通过酶催化底物显色。tseng 等使用碱性磷酸酶作为抗体的标记物,用抗-tsh多抗包被96-孔酶标板,利用碱性磷酸酶对底物对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-npp)作用,生成黄色对硝基苯酚在405nm处产生吸收,实现对tsh的检测。该法虽避免放射性元素的污染,较ria反应时间有所缩短,但由于使用分光光度法检测,灵敏度欠佳[13,14]。
随着生物技术的发展,可以获得识别两种抗原(tsh和碱性磷酸酶)的双特异抗体。morimoto等通过该双特异抗体的f(ab’)片段包被固相,酶通过免疫反应与标记抗体相联,极大减小了蛋白的干扰,使得检测灵敏度得到一定的提高[15]。
八十年代发展的时间分辨免疫荧光测定技术(time resolve
immunofluorometric assay,trifma)具有量子产率高,stoke’s位移大,发射峰窄等优点。它属于超微量免疫分析技术。该技术使用镧系元素[16,17]为示踪剂代替放射性同位素,用具有双功能基团的镧系元素来标记抗原或抗体,当解离下来的镧系元素与特制的扩增液形成新的螯合物时,其荧光明显增强而持久。90年代,papanastasion diamandi等[18]通过生物素-亲和素作用力将碱性磷酸酶与抗体相连接,碱性磷酸酶作用于底物,5-氟水杨酸磷酸酯(5-fluorosalicyl phosphate,5-fsap),生成产物5-氟水杨酸(5-fluorosalicylic acid,5-fsa)。加入铽(tb3+)-乙二胺四乙酸(edta)螯合物后形成荧光寿命长三元复合物fsa-tb3+-edta。为了满足临床快速检测,ylikotila等[19]通过生物素-亲和素之间的作用,将特异性优异的生物素化重组fab’片段与固相上的亲和素作用,减小抗体的表面积(至一斑点大小),利用高灵敏的时间分辨荧光检测,效果良好。
tsh的电化学发光检测中,常用的体系为三联吡啶钌[ru(bpy)3]2+-三丙胺氨系统[20]。加拿大的elecsyst 2010免疫分析[21,22]使用链亲和素包被的磁性微粒子,通过亲和素与生物素化抗体的相互作用,实现结合物与游离物质的分离。
化学发光测定技术按照标记方法的不同分为化学发光金标记免疫分析法和以酶标记的化学发光酶免疫分析方法。化学发光免疫分析法将发光物质如吖啶酯类化合物(如吖啶酯[23～28],吖啶盐的琥珀酰亚胺衍生物(n-succinimidyl derivative of an acridium
salt)[29],异鲁米诺等直接标记在抗原或抗体上的化学发光免疫分析法,因发光时间短,需要高精度自动分析系统。
化学发光酶免疫分析,以酶标记tsh抗原或抗体,进行免疫反应,与免疫反应复合物结合的酶作用于发光底物,用发光信号测定仪进行发光测定。常用的酶标记物为碱性磷酸酶[30]和辣根过氧化物酶[31,32]。随着,发光体系的增强剂的使用,该酶促化学发光时间得到延长。但该法检测灵敏度仍需进一步提高。
综上所述,随着生物、化学以及材料等学科的发展,针对tsh激素在检测方面的研究一直没有停止,科学家们正在努力寻求更准确、更便捷、低成本的检测方法,为内分泌疾病的临床诊断提供快速、准确的数据。
参考文献
[1] dayan,c.m.,interpretation of thyroid function
tests.the lancet,2001,357:619-624.
[2] braverman,l.e.,evaluation of thyroid status in
patients with thyrotoxicosis.clin.chem.,1996,42:174-178.
[3] frank,l.a.,petunin,a.i.,vysotski e s.bioluminescent
immunoassay of thyrotropin and thyroxine using obelin as a
label,anal.biochem.,2004,352:240-246.
[4] sgoutas,d.s.,tuten,t.e.,verras,a.a.,et al.,aqualite
bioluminescence assay of thyrotropin in serum
evaluated,clin.chem.,1995,41:1637-1643.
[5] wilkins,t.a.,brouwers,g.,mareschal,j.c.,et al.,high
sensitivity,homogeneous particle-based immunoassay for
thyrotropin (multipacttm),clin.chem.,1988,34:1749-1752. [6] ullman,e.f.,kirakossian h,switchenko a c,et
al.,luminescent oxygen channeling assay
(locitm):sensitive,broadly applicable homogeneous
immunoassay method.clin.chem.,1996,42(9):1518-1526.
[7] pekary,a.e.,hershman,j.m.,serum thyrotropin as
measured with a one-step monoclonal-antibody
radioimmunometric assay compared with two commercial
radioimmunoassay kits,clin.chem.,1986,32:1007-1009.
[8] pekary,a.e.,hershman,j.m.,a new monoclonal-antibody
two-site solid-phase immunoradiometric assay for human
thyrotropin evaluated,clin.chem.,1984,30:1213-1215.
[9] helenlus,t.,tlkanoja,s.,a sensitive and practical
immunoradiometric aassay of thyrotropin,clin.chem.,1986,
32:514-518.
[10] waite,k.v.,maberly,g.f.,ma,g.,et
al.,immunoradiometric assay with use of magnetizable
particles: measurement of thyrotropin in blood spots,to
screen for neonatal
hypothyroidism,clin.chem.,1986,32:1966-1968.
[11] cobb,w.e.,lamberton,r.p.,jackson,i.m.d.,use of a
rapid, sensitive immunoradiometric assay for thyrotropin to
distinguish normal from hyperthyroid