生物工程Vol.32,No.10,2011
2011年第10期凝结芽孢杆菌CICIMB1821发酵生产L-乳酸的研究田康明，石贵阳，王正祥*（江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江南大学生物资源与生物能源研究中心，江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心，江苏无锡214122）摘要：凝结芽孢杆菌（Bacilluscoagulans）CICIMB1821是一株实验室前期筛选获得的产L-乳酸的嗜热菌。该菌株在34~55℃范围内均表现出良好的生长特性和产酸特性，50℃时获得最高的比生长速率和最大的乳酸积累量。CICIMB1821能够在pH为5.0~7.5的范围内保持高的菌体活性。氧气的存在有利于CICIMB1821的快速生长，但会导致副产物的积累，而在不通氧的条件下该菌株也生长良好，同时产酸速率可高达5.63g/L·h。控制残糖浓度不高于10%的发酵条件下，发酵48h，可积累乳酸107.5g/L，副产物总和仅为1.05g/L，葡萄糖对乳酸的得率为97.5%，所产L-乳酸光学纯度高于99%。此外，高浓度葡萄糖发酵实验显示，该菌株可在高渗透压下利用20%葡萄糖发酵生产L-乳酸，发酵100h，可积累乳酸134g/L，副产物总和仅为1.12g/L，葡萄糖对乳酸的得率为92.0%。关键词：凝结芽孢杆菌，嗜热菌，L-乳酸，发酵生产StudyontheproductionofL-lactatebyBacilluscoagulansCICIMB1821TIANKang-ming，SHIGui-yang，WANGZheng-xiang*（CultureandInformationCenterofIndustrialMicroorganismsofChinaUniversities，CenterforBioresourceandBioenergy，JiangnanUniversity，Wuxi214122,China）Abstract：BacilluscoagulansCICIMB1821wasselectedforL-lactateproduction.Itsoptimalgrowthtemperatureandfermentationtemperaturewereprovedbothat50℃，andBacilluscoagulansCICIMB1821presentsgoodgrowthandfermentationcharacteristicsattemperaturerangefrom34℃to55℃.BacilluscoagulansCICIMB1821presentedgoodgrowthandfermentationcharacteristicsatpHrangefrom5.0to7.5.Theexistenceofoxygenwasprovedincreasingboththebiomassyieldandtheby-productconcentration.TheL-lacticacidpuritywasabove99%，theyieldfromglucosetolactatewas97.5%，andthetotalby-productamountwaslowerthan1.05g/liter，whilethelacticacidconcentrationwas107.5g/literduringthenooxygenflowingfermentationprocesswithglucoseconcentrationnomorethe10%.Whilefermentation20%glucosetolactate，andthetotalby-productamountwaslowerthan1.12g/liter，whilethelacticacidconcentrationwas134g/liter，andtheyieldfromglucosetolactaewas92%.Keywords：Bacilluscoagulans；thermophile；L-lactate；fermentation中图分类号：TS201.3文献标识码：A文章编号：1002-0306（2011）10-0245-05收稿日期：2010－10－28*通讯联系人作者简介：田康明（1985-），男，在读博士研究生，研究方向：发酵工学。基金项目：中非国际合作重点项目（2009DFA31300）。近年来，生物可降解聚合材料正在遍布日常生活和工业生产的方方面面。与石油来源的聚合材料相比，可降解、可再生的性能使得生物质的聚合材料需求量不断增加。而聚乳酸正是应用最广泛的生物质可降解聚合材料之一[1]。目前，90%的聚乳酸均由生物法发酵生产的乳酸加工聚合而成[2]。因此，建立高效的乳酸发酵生产工艺显得尤为重要。乳酸由L-乳酸和D-乳酸两种构型的单体组成。由于其构型不同，两种单体及其聚合材料的应用领域也有所差异。因此，工业生产中对乳酸的构型提出了越来越高的要求，特别是在食品和医药及相关领域，高光学纯度L-乳酸的应用更为广泛。传统的L-乳酸生产菌种为米根霉，但所产L-乳酸光学纯度不高，发酵温度较低，发酵工艺不易操作等不足限制了传统方法生产L-乳酸的发展[3]。嗜热菌用于L-乳酸的发酵生产则弥补了上述不足。凝结芽孢杆菌就是典型的代表。该菌种对营养成分要求不高，可以节约发酵成本；代谢快，可以缩短发酵周期；耐受温度高，可以减少发酵过程中对冷却水的消耗，同时也减少了染菌的可能。众多研究中已经实现了不灭菌的情况下直接发酵生245DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2011.10.038ScienceandTechnologyofFoodIndustry生物工程
2011年第10期产，大幅度降低了能耗[4]。本研究室前期筛选获得一株嗜热L-乳酸高产菌。为了进一步实现该菌株的推广应用，本研究从生长和发酵最适温度、pH、补料浓度、供氧情况等方面考察了该菌株的生长和发酵产酸的特性，并建立了高效的L-乳酸发酵工艺。1材料与方法1.1实验材料菌株来源BacilluscoagulansCICIMB1821，由江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心（CICIM-CU，http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn）提供；LB培养基（g/L）蛋白胨10，酵母膏5，NaCl10，pH7.0，添加琼脂2%即为固体培养基；种子培养基[5]（g/L）葡萄糖60，酵母膏10，蛋白胨10，无水MgSO40.25，轻质CaCO310，pH7.0~7.2（其中葡萄糖及碳酸钙单独灭菌）；发酵培养基（g/L）葡萄糖150，酵母膏10，蛋白胨2，无水MgSO40.25，轻质CaCO375，pH7.0~7.2（其中葡萄糖及碳酸钙单独灭菌）。1.2分批发酵实验1.2.1摇瓶实验种子平板培养采用LB培养基，50℃静置培养过夜。单菌落接种于液体种子培养基，250mL三角瓶中分装40mL种子培养基，50℃下200r/min培养6h，用于接种发酵培养基。乳酸发酵于250mL三角瓶中进行，每瓶分装40mL发酵培养基，用四层牛皮纸和保鲜膜将瓶口的纱布包扎住，50℃静置发酵60h。每隔6h取样测定菌体量、耗糖及产酸情况。每个参数设置三个平行实验，测定结果取平均值。考察温度对菌体生长和产酸影响时，由于不同温度下发酵液的挥发情况不同，产酸浓度值通过体积换算进行校正。如50℃发酵60h时实测浓度为35.0g/L，终体积为37mL，初始体积40mL，换算后浓度为：产酸浓度=35.0×37×100040×1000=32.4（g/L）1.2.2发酵罐放大实验1.2.2.1种子培养方式LB平板50℃静置培养过夜后，接单菌落于LB液体培养基，转速200r/min，50℃摇床过夜培养。500mL三角瓶中分装200mL种子培养基，5%接种量，50℃条件下，200r/min培养6h，用于发酵罐接种。1.2.2.2发酵培养基15L搅拌式发酵罐，初始装液量8L，罐上灭菌（121℃，20min）。葡萄糖单独灭菌后分批补加，控制补加后终浓度不高于10%，发酵结束残糖浓度不高于1%，总添加量根据具体实验要求确定。20%葡萄糖发酵实验，一次补加葡萄糖至终浓度20%。1.2.2.3其他发酵参数发酵温度50℃，调节pH至6.5，好氧阶段采用氨水调节，厌氧阶段采用25%的Ca（OH）2调节，好氧阶段控制DO值不低于30%，接种量为5%。1.3分析方法1.3.1菌体量的测定吸取0.5mL发酵液置于具塞刻度试管中，加1mL浓度为2mol/L的盐酸，将发酵液中过量的CaCO3或Ca（OH）2全部溶解，去离子水定容到所需刻度。以水为空白，于600nm处测定OD值,1OD相当于0.25g/L的细胞干重。1.3.2葡萄糖和L-乳酸的测定利用生物传感分析仪（SBA-40C，山东科学院生物研究所）测定残糖浓度和L-乳酸产量。1.3.3总乳酸和副产物的测定高压液相色谱法测定总乳酸产量。仪器：dionexp680，ShodexSUGARSH1011；柱温：50℃；流动相：0.01mol/LH2SO41mL/min；检测器：示差折光检测器。1.3.4光学纯度的测定高压液相色谱法测定L-乳酸的光学纯度。仪器：dionexp680，AstecCLC-L；柱温：24℃；流动相：5mmol/LCuSO41mL/min；检测器：dionexUVD170U；检测波长：254nm。1.3.5数据处理生长曲线的拟合、生长速率和比生长速率的计算均由绘图软件Origin8.0辅助完成。2结果与讨论2.1不同温度对BacilluscoagulansCICIMB1821生长和发酵产酸的影响考察了不同温度（34、37、42、45、50、55℃）对BacilluscoagulansCICIMB1821生长和发酵产酸的影响。对比图1中的数据可以看出，在不同的发酵温度下，菌体生长状况差异明显。随着发酵温度的升高，菌体的倍增时间逐渐缩短，但是55℃条件下菌体的倍增时间没有继续缩短而是增加到接近42℃时的倍增时间。通过对生长曲线拟合和进一步计算发现，42℃发酵温度下，菌体获得了最高的生长速率（见图2），而在37℃发酵温度下，菌体获得了最高的菌体量，最大比生长速率和最高的乳酸积累量则在50℃发酵温度下获得（见图3和表1）。菌体生长是一个复杂的过程，众多因素都影响着菌体的生长状况，如温度、pH、供氧强度、底物浓度、产物浓度等，其中温度的影响往往是比较显著的，菌体合成和代谢所依赖的各种酶都会受到温度的显著影响。M.V.Jones等人[6]研究了一株凝结芽孢杆菌（Bacilluscoagulans）中在TCA循环中起关键作用的四种酶的热稳定性能，发现其中三种酶最适作用温度在60℃以上，而苹果酸脱氢酶的最适作用温度为43℃。这一结论可以从酶作用温度的角度为本研究中42℃发酵温度下菌体获得最大生长速率提供理论依据。M.V.Jones等人对比发现，四种酶55℃条件下的比酶活较30℃条件下高出三倍多；本研究中则发现，55℃发酵温度下菌体的最大比生长速率是34℃条件下的3.5倍，34℃发酵温度下菌体的倍增时间则是55℃条件下的3.1倍。发酵生产过程中，除了要考虑菌体生长的最适温度，还涉及到温度对产物合成的影响。对比乳酸产量的不同，确定50℃为后续研究的基础发酵温度。此外，对该菌株碳源利用情况的考察显示，BacilluscoagulansCICIMB1821可以利用葡萄糖和木糖进行乳酸的发酵生产，这为后续开发利用纤维素水解液发酵生产乳酸奠定了基础。而目前广泛使用的纤维素水解酶类在50℃条件下的酶活力是30℃条件下的三倍[7]。这也为选择50℃作为后续研究的基础发酵温246