• 6、凝结芽孢杆菌经90℃，60min 湿热处理和 、凝结芽孢杆菌经 ℃ 120℃，60min 干热处理，其活菌数只下降了 干热处理， ℃ 一个数量级；将其置于pH 值大于2.42 的酸性 一个数量级；将其置于 值大于 溶液中，存放一年后，其存活率仍高达105； 溶液中，存放一年后，其存活率仍高达 ； 凝结芽孢杆菌在1%～ 凝结芽孢杆菌在 ～7% NaCl 溶液中均可存活 4 周以上，其在 NaCl 溶液中能存活一个月。 周以上，其在8% 溶液中能存活一个月。 但凝结芽孢杆菌在低pH 值条件下， 但凝结芽孢杆菌在低 值条件下，其抗逆性 会下降。例如在酸性条件下(pH4.0)，凝结芽孢 会下降。例如在酸性条件下 ， 杆菌孢子对热几乎没有耐受性， 杆菌孢子对热几乎没有耐受性，而且生长受到 抑制。此外， 等也发现在pH 值小于4.5 抑制。此外，Cerrutti 等也发现在 值小于 和水活度0.96 条件下，凝结芽孢杆菌的生长受 条件下， 和水活度 到抑制。 到抑制。
• 2、接斜面：将分离的菌种转接到种子斜面 接斜面： 接斜面 培养基, 培养24 备用。 培养基 40 ℃培养 h, 备用。 • 3、种子液的制备：取一环活化的菌种 接入 、种子液的制备：取一环活化的菌种, 装液量为50 液体培养基的250 mL 三 装液量为 mL YPD液体培养基的 液体培养基的 角瓶中, 培养18 。 角瓶中 40 ℃, 180 r/min,培养 h。 培养 • 4、摇瓶培养：分别取 mL( 接种量为 , V/ 接种量为2% 、摇瓶培养：分别取1 V) 种子液 接入盛有 mL 培养基的 种子液,接入盛有 接入盛有50 培养基的250 mL 三角瓶中。置摇床中, 振荡培养12 三角瓶中。置摇床中 30 ℃ 振荡培养 h, 转速为160 r/ min。 转速为 。
• 5、菌株在YPD 培养基上生长良好 48 h 形 、菌株在 培养基上生长良好, 成直径2~3 mm 大小的圆形菌落 白色而有 大小的圆形菌落, 成直径 光泽, 表面湿润、平坦, 边缘整齐。 光泽 表面湿润、平坦 边缘整齐。油镜观 菌体形态为杆状, 单个、 察, 菌体形态为杆状 单个、成对或链状排 芽胞端生。 列, 芽胞端生。
• 6、《益生凝结芽孢杆菌 的液体深层发酵培养》 、 益生凝结芽孢杆菌AHU1366 的液体深层发酵培养》 • 发酵培养基的组成为：麸皮4 %、豆粕粉 发酵培养基的组成为：麸皮 、豆粕粉1. 5 %、NaCl 0. 5%、K2HPO4 4%、MnSO4 、 、 、 30.8mg/ L, pH 7. 2~ 7. 4。 。 • 最佳发酵条件为：250 mL 三角瓶中装液体 最佳发酵条件为： 积为15 接种量4 积为 mL, 接种量 % , 37 ℃, 180 r/ min, 摇 瓶培养56 在优化后的培养条件下 在优化后的培养条件下, 瓶培养 h,在优化后的培养条件下 生物量 OD600达到 68, 芽孢形成率为 % 。 达到19. 芽孢形成率为80 达到
4、培养条件 、
• 1、分离纯化：将药片粉碎加入到10ml无菌 、分离纯化：将药片粉碎加入到 无菌 试管中，加入灭菌的蒸馏水，震荡摇匀， 试管中，加入灭菌的蒸馏水，震荡摇匀， 静置。取上清2ml加入到改良 加入到改良MRS 培养基 静置。取上清 加入到改良 静置培养。然后从每个样品取2 中,37 ℃静置培养。然后从每个样品取 ml, 80 ℃水浴 min 后取 水浴5 后取0.1 ml转接乳酸菌增殖 转接乳酸菌增殖 培养基固体平板, 培养。待菌落长出, 培养基固体平板 37 ℃培养。待菌落长出 随机挑取菌落,纯化 编号并保存。 纯化,编号并保存 随机挑取菌落 纯化 编号并保存。
• 6、碳源是影响芽孢形成的重要因素，高浓度碳源 、碳源是影响芽孢形成的重要因素， 会抑制芽孢的形成。 会抑制芽孢的形成。 • 7、无机盐在调控芽孢形成中发挥重要作用。Mn2+ 、无机盐在调控芽孢形成中发挥重要作用。 对芽孢的形成起到显著作用，当浓度在0.005%～ 对芽孢的形成起到显著作用，当浓度在 ～ 0.1% 范围内，对芽孢的形成有促进作用，当浓度大 范围内，对芽孢的形成有促进作用， 对菌体生长有抑制作用。 于0.10% 时，对菌体生长有抑制作用。PO4 3-也有利 于芽孢的形成， 于芽孢的形成，而K+ 和Na+ 对凝结芽孢杆菌芽孢的 形成无明显促进作用，无机盐的作用遵循“ 形成无明显促进作用，无机盐的作用遵循“适量促 过量抑制”的原则。 进、过量抑制”的原则。 • 8、王进华等研究发现高温对芽胞的形成有明显影 、 响。50℃条件下芽胞的形成率可以达到 ℃条件下芽胞的形成率可以达到57.7%，而 ， 且减少通气量有助于芽胞的形成。 且减少通气量有助于芽胞的形成。 • 9、王天云等则在培养细胞后期加入固体介质可以 、 促进芽孢的形成，例如木屑、碎布屑和玉米芯。 促进芽孢的形成，例如木屑、碎布屑和玉米芯。而 且芽孢形成率达9 以上， 且芽孢形成率达 5% 以上，通常在添加后静置培养 48h 后芽孢就可以形成。 后芽孢就可以形成。
5、技术关键
• 1、结芽孢杆菌为兼性厌氧菌，好氧厌氧条件 、结芽孢杆菌为兼性厌氧菌， 下不影响生长， 下不影响生长，但由于芽孢是在营养缺乏的条 件下产生的，所以若要考虑芽孢量的多少， 件下产生的，所以若要考虑芽孢量的多少，通 气量还是不可少的条件。 气量还是不可少的条件。 • 2、试验从装液量和转速方面来研究，最终的 、试验从装液量和转速方面来研究， 结果是当转速为210r/min、装液量为 结果是当转速为 、装液量为30mL 三角瓶） （250mL三角瓶）时产芽孢量最多。 三角瓶 时产芽孢量最多。 • 3、对于培养温度，过低导致菌的生长缓慢， 、对于培养温度，过低导致菌的生长缓慢， 不利于芽孢形成，过高的温度下菌自溶得快， 不利于芽孢形成，过高的温度下菌自溶得快， 还没来得及产芽孢就自溶了， 还没来得及产芽孢就自溶了，也不利于芽孢的 形成，最适产孢温度为40℃ 形成，最适产孢温度为 ℃。
• 4、凝结芽孢杆菌在培养过程中会产乳酸，使 、凝结芽孢杆菌在培养过程中会产乳酸， 得菌液的pH值降低 值降低， 得菌液的 值降低，所以要求发酵液的初始 pH值不能太低，但如果 值太高，又不利于 值不能太低， 值太高， 值不能太低 但如果pH值太高 菌的生长，得不到较多的芽孢， 菌的生长，得不到较多的芽孢，所以本试验设 计的初始pH值为 值为6.5~7.5。 计的初始 值为 。 • 5、芽胞形成率依赖于细胞密度，在菌体浓度 、芽胞形成率依赖于细胞密度， 达到10 的过滤培养中， 达到 10cfu/mL的过滤培养中，芽胞形成率上 的过滤培养中 升至60%。在摇瓶条件下，添加由相同菌株发 升至 。在摇瓶条件下， 酵液制备而来的条件培养基可以促进芽胞的形 芽胞形成率为62.5%以上， 以上， 成，芽胞形成率为 以上
• 2、凝结芽孢杆菌增殖培养基(YPD 培养基 : 、凝结芽孢杆菌增殖培养基 培养基) 葡萄糖20 、胰蛋白胨20 、酵母粉10 、 葡萄糖 g、胰蛋白胨 g、酵母粉 g、 灭菌20 水1 000 ml, 调pH值7.0, 115 ℃灭菌 min。 值 。 • 3、固体培养基 在液体培养基的基础上添 、固体培养基: 的琼脂。 加1.5%的琼脂。 的琼脂 • 4、种子培养基 蛋白胨10 、种子培养基(W/ V) : 蛋白胨 g/L, 酵母 浸出物5 氯化钠10 浸出物 g/ L, 氯化钠 g/ L, 固体培养基再 加琼脂15 自然pH。 加琼脂 g/ L, 自然 。 • 5、基础发酵培养基(W/ V) : 蔗糖10 g/L, 蛋 、基础发酵培养基 蔗糖 白胨10 磷酸氢二钠2 磷酸二氢钠2 白胨 g/ L, 磷酸氢二钠 g/ L, 磷酸二氢钠 g/ L,pH 7. 0。 。
实验条件优化
• 5、优化后的培养基配方为：酵母粉3g/L， 、优化后的培养基配方为：酵母粉 ， 蛋白胨5g/L，牛肉膏 蛋白胨 ，牛肉膏2g/L，MnSO40.005g/L， ， ， NaCl 2g/L，K2HPO4 3g/L，MgSO4 0.02g/L， ， ， ， 在此培养基基础上进行发酵条件的优化， 在此培养基基础上进行发酵条件的优化， 得出优化后的培养条件为：温度40℃ 得出优化后的培养条件为：温度 ℃，初 值为7.0，转速210r/min，装液量为 始pH值为 ，转速 值为 ， 30mL（250mL的三角瓶），接种量为 的三角瓶），接种量为6% （ 的三角瓶），接种量为 ），发酵时间 （v/v），发酵时间 ），发酵时间48h。 。
3、培养基 、
• 1、分离培养基（MRS 培养基）：胰蛋白胨 、分离培养基（ 培养基）：胰蛋白胨 ）： 10 g、牛肉膏 g、柠檬酸二铵 g、乙酸钠 、牛肉膏10 、柠檬酸二铵2 、 5 g、酵母粉 g、葡萄糖 g、磷酸二氢钾 g、 、酵母粉5 、葡萄糖5 、磷酸二氢钾2 、 吐温80 吐温 1.0 ml、碳酸钙 g、硫酸镁 、碳酸钙20 、硫酸镁0.58 g、 、 硫酸锰0.25 g、水1 000 ml, 调pH 值6.2～6.5, 硫酸锰 、 ～ 115 ℃灭菌 min。 灭菌20 。 • 改良 改良MRS 培养基 在MRS 培养基基础上添加 培养基: α-甲基葡萄糖苷 g、山梨酸钾 g, 调pH 值 甲基葡萄糖苷10 、山梨酸钾1 甲基葡萄糖苷 6.2~6.5,115 ℃灭菌20 min。 灭菌 。
一、凝结芽孢杆菌
• • • • • 1、分类地位 、 2、用途意义 、 3、培养基 、 4、 4、培养条件 5、技术关键 、
1、分类地位 、
• 1、凝结芽孢杆菌是乳酸菌的一种。 、凝结芽孢杆菌是乳酸菌的一种。 • 2、凝结芽孢杆菌 呈杆状， 、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)呈杆状， 呈杆状 两端钝圆，革兰氏阳性菌，过氧化氢酶阳性， 两端钝圆，革兰氏阳性菌，过氧化氢酶阳性， 芽胞端生，无鞭毛。 芽胞端生，无鞭毛。 • 3、最适生长温度为 ～50℃，最适 值为 、最适生长温度为45～ ℃ 最适pH 6.6～7.0。其能分解糖类生成 乳酸，为同型 ～ 。其能分解糖类生成L- 乳酸， 乳酸发酵菌。 乳酸发酵菌。 • 4、凝结芽孢杆菌除具有和乳酸菌及双歧杆菌 、 同样的保健功效外，还具有耐酸、耐热、耐盐、 同样的保健功效外，还具有耐酸、耐• • • • • 1、对胃肠道炎症有一定治疗作用。 、对胃肠道炎症有一定治疗作用。 2、调节动物消化道的微生态平衡。 、调节动物消化道的微生态平衡。 3、促进动物机体的消化作用。 、促进动物机体的消化作用。 4、改善动物机体免疫功能 提高抗病能力。 、改善动物机体免疫功能, 提高抗病能力。 5、促进动物生长、降低死亡淘汰率和饲料增重比。 5、促进动物生长、降低死亡淘汰率和饲料增重比。 6、人体保健作用包括：提高消化道对膳食纤维的 、人体保健作用包括： 有效利用率，防止脂肪分子的过度吸收（ 有效利用率，防止脂肪分子的过度吸收（降脂作 ）；减少患冠心病的危险 抗便秘； 减少患冠心病的危险； 用）；减少患冠心病的危险；抗便秘；预防沙门氏 轮状病毒、 菌、轮状病毒、副溶血弧菌等致病微生物引起的腹 泻。