第１４卷第３期 ２０１３年６月 北华大学学报（自然科学版） ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＥＩＨＵＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ） Ｖｏ１．１４ Ｎｏ．３ Ｊｕｎ．２０１３
文章编号：１００９－４８２２（２０１３）０３４３２９９４３３ ＤＯＩ：１０．１１７１３／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９４８２２．２０１３．０３．０ｌ１
关白附提取物的抗氧化活性研究
翟松涛 ，祝铭。，翟明月 ，佟海滨 ，孙新
（１．北华大学生命科学研究中心，吉林吉林１３２０１３；２．北华大学第一临床医学院，吉林吉林１３２０１３）
摘要：目的研究关白附发挥抗氧化活性的有效部位．方法７０％乙醇回流提取关白附粉末，减压浓缩得到乙醇 浸膏，并依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取；采用ＤＰＰＨ法、Ｆｅｎｔｏｎ法及邻苯三酚自氧化法研究体外抗 氧化活性．结果不同溶剂萃取得到的关白附提取物展现出不同程度的抗氧化活性，并呈现量效关系．其中，正 丁醇提取物对ＤＰＰＨ、超氧阴离子以及羟自由基的清除活性均为最高．结论关白附正丁醇提取物具有较强的 抗氧化活性，可作为一种新的自由基清除剂和天然抗氧化剂． 关键词：关白附；提取物；抗氧化活性；ＤＰＰＨ 中图分类号：Ｒ２８４．２ 文献标志码：Ａ
Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ａｃｏｎｉｔｕｍ Ｃｏｒｅａｎｕｍ Ｅｘｔｒａｃｔｓ
ＺＨＡＩ Ｓｏｎｇ—ｔａｏ ，ＺＨＵ Ｍｉｎｇ ，ＺＨＡＩ Ｍｉｎｇ—ｙｕｅ ，ＴＯＮＧ Ｈａｌ—ｂｉｎ ，ＳＵＮ Ｘｉｎ （ ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆＢｅｉｈｕａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｌｉｎ １３２０１３，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｆｉｒｓｔ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｉｈｕａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｌｉｎ １３２０１３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐａｒｔｓ ｏｆ Ａｃｏｎｉｔｕｍ ｃｏｒｅａｎｕｍ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ． ｎｅｔｈｏｄ ７０％ｅｔｈａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｏｎｉｔｕｍ ｃｏｒｅａｎｕｍ ｗａｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｕｎｄｅｒ ｒｅｄｕｃｅｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ａｎ ｅｔｈａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔ，ａｎｄ ｆｕｒｔｈｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ ｅｔｈｅｒ，ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ，ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ ａｎｄ ｎ．ｂｕｔａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔ：ＤＰＰＨ ｍｅｔｈｏｄ，Ｆｅｎｔｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ ａｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｌｖｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ Ａｃｏｎｉｔｕｍ ｃｏｒｅａｎｕｍ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ．ｓｈｏｗｉｎｇ ａ ｄｏｓｅ—ｅｆｆｅｃｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ．Ａｍｏｎｇ ｔｈｅｍ，ｎ—ｂｕｔａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ ＤＰＰＨ，ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａ１．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ｎ．ｂｕｔａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ａｃｏｎｉｔｕｍ ｃｏｒｅａｎｕｍ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｓｔｒｏｎｇ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ． ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｓ ａ ｎｅｗ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｔｉ—ｏｘｉｄａｎｔｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｃｏｎｉｔｕｍ ｃｏｒｅａｎｕｍ；ｅｘｔｒａｃｔｓ；ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＤＰＰＨ
关白附系毛茛科乌头属植物黄花乌头
Ａｃｏｎｉｔｕｍ ｃｏｒｅａｎｕｍ的块根，又名白附子、竹节白附 等，在我国河北北部、辽宁、吉林、黑龙江东部等地 均有分布，主要生长在海拔２００—９００ ｍ的山地草 坡或树林中 ．我国传统医学表明：关白附具有祛
风痰、定惊痫、散寒止痛作用，主治中风痰壅、口眼 歪斜、癫痫、偏头痛等 Ｊ．现代药理研究表明：关白
附有良好的抗心律失常、抗炎和镇痛作用，从关白 附中提取生物碱制成治疗心血管疾病的药物，已取 得一定成果 』．此外，关白附中还含有萜类及糖苷
类、有机酸类、氨基酸类、酚类、糖类等多种活性物 质，在抗病毒、免疫调节功能等方面具有良好的生 物学活性．本研究利用试剂萃取的方法以及体外抗
氧化模型，探讨了关白附提取物的抗氧化活性，为
关白附作为自由基清除剂和天然抗氧化剂方向的 开发利用提供理论依据．
收稿日期：２０１３－０２－０２ 基金项目：吉林省科技发展计划项目（２￣８０９０６，２０１１１８０９，２０１２０１１４３）；吉林省教育厅科学技术研究项目（２０１２－１２４，２０１２．１７１，２０１３－１６９） 作者简介：翟松涛（１９６８一），男，药剂师，主要从事中药药理学研究．
３ｏ０ 北华大学学报（自然科学版） 第１４卷
１材料与方法
１．１材料与仪器
关白附（吉林马应龙制药有限公司提供）；１，１． 二苯基一２．苦苯肼自由基（１，１一ｄｉｐｈｅｎｙ１．２．
ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ ｒａｄｉｃａｌ，ＤＰＰＨ），２，６－二叔丁基４一甲基 苯酚（２，６－ｄｉｔｅｒｔｂｕｔｙｌ－４－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｏｌ，ＢＨＴ）（美国 Ｓｉｇｍａ公司）；番红花红、ＥＤＴＡ—Ｎａ２（北京鼎国生物 公司）；邻苯三酚、无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正 丁醇，均为国产分析纯． Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ．１００紫外一可见分光光度计，
Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ ６４Ｒ高速离心机，ＳＩＭ ＭＣＦＤ５５０８ 冷冻干燥机，ＲＥ．５２型旋转蒸发仪，ＦＷ１００粉碎机， ＳＨＢ一３循环水多用真空泵． １．２关白附提取物的制备 将干燥的关白附粉碎后，精确称取关白附粉末 １０．０ ｇ，滤纸包裹并置于索氏提取器中，加入７０％ 的乙醇溶液提取２ ｈ，反复提取３次后合并提取液，
过滤，滤液经减压浓缩得到乙醇提取液浸膏．将乙 醇提取液浸膏转入分液漏斗，加２００ ｍＬ蒸馏水溶
解，依次使用等体积的石油醚、乙酸乙酯以及正丁 醇进行萃取，各相萃取液减压浓缩后依次得到石油 醚、乙酸乙酯以及正丁醇提取物． １．３ ＤＰＰＨ自由基清除作用 分别将关白附提取物（石油醚、乙酸乙酯、正
丁醇提取物）及ＢＨＴ溶解于甲醇中，配制成质量浓 度为０．１，０．２５，０．５，１，２，４，８ ｍｇ／ｍＬ的溶液．取不 同浓度的关白附提取物溶液０．５ ｍＬ，加入１．５ ｍＬ
ＤＰＰＨ甲醇溶液（０．８ ｍｍｏ１），强烈振荡后避光静置 ３０ ｍｉｎ，分光光度计于５１５ ｎｍ处测定吸光值，按下 式计算对ＤＰＰＨ自由基的清除率 Ｊ：清除率＝
Ａ（样品一空白）／Ａ（对照．空白）×１００％． １．４超氧阴离子自由基清除作用
利用邻苯三酚自氧化法测定关白附提取物对超 氧阴离子自由基的清除作用 Ｊ．取ｐＨ为８．２的Ｔｒｉｓ—
ＨＣ１缓冲液３ ｍＬ，并向试管中加入Ｏ．５ ｍＬ不同浓度的
关白附提取物，试管置于３７℃水浴中１０ ｍｉｎ，加入３７ ｃＣ预热过的邻苯三酚溶液（７ ｍｍｏ１）１ ｍＬ，充分混匀后 精确反应４ ｍｉｎ，最后用０．５ ｍＬ浓盐酸终止反应，分光 光度计于３２０ ｎｍ处测定吸光度。 １．５羟自由基清除作用
采用Ｆｅｎｔｏｎ体系 评价关白附提取物对・ＯＨ 自由基的清除作用．Ｆｅｎｔｏｎ反应原理是：溶液状态 下，Ｆｅ“与Ｈ：Ｏ 反应可以产生・ＯＨ，而・ＯＨ可使番 红花红褪色，利用比色法于５２０ ｎｍ处测定溶液的 褪色程度，反映对・ＯＨ的清除作用． 每支试管分别加入１．５ ｍＬ ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）， ０．２ ｍＬ番红花红溶液（２６０ ｍｇ／Ｌ），０．８ ｍＬ Ｈ２０２
（３％），０．７ ｍＬ ＥＤＴＡ—Ｎａ２一Ｆｅ“溶液（２ ｍｍｏ１），再分
别向试管中加入０．８ ｍＬ不同浓度的关白附提取 物，充分震荡混匀后置于３７℃水浴中保温３０ ｍｉｎ，空 白试管以蒸馏水代替试样，对照试管以Ｈ：Ｏ 代替试
样和ＥＤＴＡ－Ｎａ２－Ｆｅ“，于５２０ Ｂｉｎ处测定吸光度．
２ 结 果
２．１ 关白附提取物清除ＤＰＰＨ自由基能力 ＤＰＰＨ是一种稳定的自由基，可以在有机溶剂 中稳定存在，在５１７ ｎｍ波长处有最大吸收．当加入
抗氧化剂时，抗氧化剂可以与ＤＰＰＨ的孤对电子配 对，导致ＤＰＰＨ在５１７ ｎｍ波长下吸收消失或减弱． 因此，通过测定ＤＰＰＨ吸光度的变化程度可评价样 品抗氧化能力的高低．关白附提取物的ＤＰＰＨ清除
活性见图１，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物和对照 ＢＨＴ的ＤＰＰＨ清除活性随着其浓度的增加而迅速上
升，清除活性呈量效关系．而当提取物的浓度大于 ２ ｒａｇ／ｍＥ时，尽管样品浓度不断增加，但其ＤＰＰＨ自由 基清除能力增加缓慢．与阳性对照组ＢＨＴ相比，各提 取物的ＤＰＰＨ自由基清除活性均低于ＢＨＴ．不同溶剂 关白附提取物的ＤＰＰＨ自由基清除活性大小顺序为：
正丁醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞石油醚提取物．
第３期 翟松涛，等：关白附提取物的抗氧化活性研究 ３０１
型，检测关白附提取物的Ｏ ・清除能力
鬟
舜 辘
图２ 关白附提取物对超氧阴离子的清除活性 Ｆｉｇ．２ Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ Ａｃｏｎｉｔｕｍ ｃｏｒｅａｎｕｍ 由图２可知：随着关白附提取物浓度的增加，
０ ・自由基的清除率不断增高，在试验设计的质 量浓度范围内，提取物质量浓度与０ ・自由基清
除率呈量效关系．而当提取物质量浓度大于
０．５ ｍｇ／ｍＬ时，正丁醇、乙酸乙酯提取物对０ ・自 由基清除活性均略高于ＢＨＴ对照组．关白附提取
物的０ ・自由基清除活性大小顺序为：正丁醇提 取物＞乙酸乙酯提取物＞石油醚提取物．
２．３关白附提取物对羟自由基的清除活性 羟自由基（・ＯＨ）是机体内最为活泼的活性氧
类型，具有极强的攻击性和破坏性，它能破坏细胞 中的脂质分子、蛋白质、ＤＮＡ等生物大分子，是引 起细胞坏死或恶性转化的诱因之一，对人体危害极
大．因此，寻找高效清除羟自由基的抗氧化物具有 重要意义． 利用Ｆｅｎｔｏｎ反应，我们检测了关白附提取物 对羟自由基的清除能力．由图３可知：随着关白附 不同溶剂提取物质量浓度的增加，羟自由基的清除
率不断提升，在实验设计的质量浓度范围内，提取
物质量浓度与羟自由基清除率呈量效关系．各提取 物表现出较为接近的抗氧化能力，正丁醇提取物的 抗氧化活性略高于乙酸乙酯、石油醚提取物，但均
低于ＢＨＴ对照组．关白附提取物的羟自由基清除 活性大小顺序为：正丁醇提取物＞乙酸乙酯提取物 ＞石油醚 ｌ 冰 褂 惦 餐 蝴 趣 ・血
图３ 关自附提取物对羟自由基的清除活性 Ｆｉｇ．３ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ Ａｃｏｎｉｔｕｍ ｃｏｒｅａｎｕｍ ｏｎ Ｈｙｄｒｏｘｙ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ３讨 论
我国的中草药资源是宝贵的天然活性化合物
宝库，从传统中草药中筛选出具有清除自由基活性 的天然物质已引起国内外学者的广泛重视．已有大 量报道从中草药材中可以分离出酚类、黄酮类化合 物，这些成分展现出极强的抗氧化活性 ．天然活
性成分的抗氧化作用机制比较复杂，作用靶点各 异．在不同的抗氧化评价体系中，由于各种评价方 法的机理不同，而使得同一天然化合物可能表现出
不同的抗氧化活性．因而，在筛选抗氧化剂时，需要 建立一套多层面氧化模型评价体系，多种方法并用衡 量中草药活性分子的抗氧化能力是很有必要的．本研 究综合运用ＤＰＰＨ自由基法、Ｆｅｎｔｏｎ反应和邻苯三酚
自氧化法，初步研究了不同溶剂萃取得到关白附提取 物的抗氧化活性．我们发现在不同的氧化模型评价体 系下，正丁醇提取物均展现出良好的抗氧化活性，可
能与正丁醇提取物中含有大量的黄酮、酚类、生物碱、 有机酸等具有较强抗氧化活性的化合物有关．
参考文献：
Ｊ １ ｉ Ｖａｌｋｏ Ｍ，Ｌｅｉｂｆｒｉｔｚ Ｄ，Ｍｏｎｃｏｌ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２Ｏ０７，３９：４４—８４． ｆ ２】Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ Ｂ． Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｕｔｒ，１９９６，１６：３３—５０． ［３］王亚娟．黄花乌头化学成分研究概况［Ｊ］．时珍国医 国药，２００６，１７（４）：６３８—６３９． ［４］毛淑杰，李先端．中药关白附现状研究概况［Ｊ］．基层 中药杂志，１９９５，９（２）：３３．３６． ［５］柯青，毛淑杰．关白附不同炮制品抗心律失常研究［Ｊ］．中 国中药杂志，１９９６，２１（１）：２５—２７． ［６］Ｙａｎｇ Ｘ Ｍ，Ｙｕ Ｗ，Ｏｕ Ｚ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｗａｔｅｒ Ｅｘｔｒａｃｔ ａｎｄ Ｃｒｕｄｅ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｆｒｏｍ Ｆ／ｃｕｓ Ｃａｒ／ｃａ Ｌ．Ｆｒｕｉｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｆｏｏｄｓ Ｈｕｍ Ｎｕｔｒ，２００９，６４：１６７—１７３． ［７］Ｙｕａｎ Ｈ，Ｓｏｎｇ Ｊ，Ｚｈａｎｇ Ｗ，ｅｔ ａ／．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｋａｐｐａ—ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｄｉｆｅｒｅｎｔ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ， ２ＯＯ６，１６：１３２９－１３３４． Ｉ ８ ｌ Ｗａｎｇ Ｚ Ｊ，Ｌｕｏ Ｄ Ｈ．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｄｉｆｅｒｅｎｔ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ Ｇｙｎｏｓｔｅｍｍａ Ｐｅｎｔａｐｈｙｌｌｕｍ Ｍａｋｉｎｏ［Ｊ］．Ｃａｒｂｏｈｙｄ Ｐｏｌｙｍ，２Ｏ０７，６８：５４－５８． ［９］Ｐｒｉｏｒ Ｒ Ｌ，Ｗｕ Ｘ，Ｓｃｈａｉｃｈ Ｋ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｃａｐａｃｉｔｙ ａｎｄ Ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ ｉｎ Ｆｏｏｄｓ ａｎｄ Ｄｉｅｔａｒｙ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２００５，５３：４２９０－４３０２． 【责任编辑：陈丽华】