生物酶法制备生物柴油研究综述分数低于0.0005 %，十六烷值高达73.6，在0#柴油中添加了 20%的生物柴油后，尾气排放中 CO 降低了28%，未燃烧的碳氢化合物降低了 36 %，NOx降低了24 %，全负荷烟度下降幅度达到 0.2～0.9 Rb。

蔡志强等[10]探究了固定化脂肪酶分别催化酯化与醇解两种方法合成生物柴油的最佳工艺条件。

研究发现，酯化工艺的最佳工艺条件是：2%固定化脂肪酶，温度为30 ℃，油酸∶甲醇=1∶1（摩尔比），分 2 次等摩尔流加甲醇，反应时间 24 h，或分 3 次等摩尔流加甲醇，反应时间 36 h，酯化率都可以达到 95%以上；醇解的最佳工艺条件是：4%固定化脂肪酶，温度为30 ℃，菜籽油∶甲醇=1∶3（摩尔比），分 3 次等摩尔流加甲醇，反应时间为 48 h，酯化率可以达到 95%以上，去除下层甘油后，菜籽油甲酯纯度可达 98%。

安永磊等[11]利用固定化脂肪酶催化餐饮废油与乙醇反应制备生物柴油。

通过实验获得了酯化反应的最佳条件：反应温度47 ℃，有机溶剂为正己烷，醇油比3∶1，5 次投加乙醇，酶用量为 0.3 g，反应时间 32 h 时，生物柴油产率可达 81%。

徐桂转等[12]利用固定化脂肪酶 Novozym 435，在无有机溶剂存在的情况下，催化菜籽油与甲醇酯交换反应制取生物柴油。

研究得到了菜籽油间歇酯交换反应的适宜工艺条件：转速200 r/min，反应温度：50 ℃，甲醇∶菜籽油=1∶5（摩尔比），酶用量 10%（与菜籽油的质量比）。

反应分两次加入等量甲醇，即先加入总量一半的甲醇，反应 10 h（菜籽油的酯交换率达到 47%）；再加入剩下全部甲醇，反应26 h（酯交换率达到80%）。

唐凤仙等[13]以戊二醛交联壳聚糖固定的 A.niger Li-38脂肪酶催化棉籽毛油合成生物柴油取得了不错的效果。

研究发现该固定化酶的贮藏稳定性较好，室温放置 12 d, 酶活性仍能保持 80%以上。

固定化酶在30~70 ℃，pH=5.5~6.5 之间较稳定，其热稳定性和 pH 稳定性较游离酶有所提高。

固定化酶可重复使用 7 次，转化率保持在80%以上。

洪鲲等[14]研究了两种脂酶顺序催化制备生物柴油的生产工艺。

结果表明：固相化细菌 A007 脂酶催化甘油三酯（TAG）水解的最适条件为：含水量 40%、脂酶用量100 U/g、反应温度30 ℃、反应时间 12 h，此时 TAG水解率和游离脂肪酸（FFA）含量分别为 93.3%和90.1%；在催化 FFA 甲酯化过程中，固相化 Candidaantarctica 脂酶在FFA∶甲醇=1∶5 时可达到最佳效果；在第二次甲酯化时，加入甘油有利于提高FFA 酯化率，经过 24 h 反应，可将总酯化率从无甘油时的 96.9%提高到 98.6%。

2.2液体脂肪酶法早在 1970 年代许多学者就发现脂肪酶在油水界面上催化反应速率较快，A. M. Brzozowski 等[15]将此现象解释为“界面活化效应”。

一般而言，脂肪酶活性位点为一个盖子所罩住，界面活化效应是指将此盖子打开使催化活性位点暴露出来。

液体脂肪酶通过催化两相（油相/水相）体系界面的转酯/酯化反应制备生物柴油。

基于双相体系、油水界面活性效应的特点，液体酶法催化制备生物柴油的反应速率较快，不受底物、产物的扩散限制，产物、副产物易分离。

此外，液体脂肪酶生产工艺简单，成本低廉[16]。

许多学者对脂肪酶的盖式结构进行了探究。

薛龙吟等[17]比较了黑曲霉脂肪酶与黑曲霉酯酶的 3-D 结构后发现两者在盖子结构域存在显著差异。

他们利用PCR 技术对黑曲霉脂肪酶的 4 个位点进行诱变，以期获得开盖型黑曲霉脂肪酶。

4 个重组质粒导入毕式酵母 GS115 菌株进行异源表达后，仅 pPC19K-anl-D99P和 pPC19K-anl-K108E 实现了活性表达。

李堂等[18]研究脂肪酶催化菜籽油乙醇解反应的几个主要影响因素的结果表明，采用正己烷作溶剂，能有效增加反应体系中乙醇与菜籽油的互溶性，使反应物充分接触，有效降低乙醇的局部浓度，减小其对酶的毒害作用，消除酶的团聚现象，改善脂肪酶所处微环境。

2.3全细胞法酶法生产生物柴油进入商业化应用的最大障碍是脂肪酶的成本太高，一个很有前景的解决方法是以全细胞生物催化剂的形式利用脂肪酶[19]。

清华大学的曾静等[20]利用霉菌 R. oryzae IFO 细胞催化植物油脂与甲醇醇解反应合成生物柴油，通过探究培养过程中各项参数对细胞生长以及该细胞催化剂对醇解反应活性的影响，发现细胞的催化活性随细胞培养过程中添加油脂的不同而变化。

在优化的操作参数（大豆精制油 20 g/L，蛋白胨 70 g/L，NaNO31.2g/L，KH2PO41.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，培养温度35 ℃，摇床转速 130 r/min）下培养得到的细胞催化剂能有效催化大豆油与甲醇三步转化酯化反应生成生物柴油，最终得率可达86%。

3结语生物柴油的研究因当今世界石油危机而得到大力发展。

生物柴油技术的研发利用对世界能源结构、我国巨大的能源需求、生态环境保护、资源的可持续利用都有着至关重要的意义。

酶法催化制备生物柴油具有清· 60·江西林业科技 2012 年第 1 期生物酶法制备生物柴油研究综述郑青荷（南京林业大学化学工程学院，江苏南京 210037）摘要：就生物酶法制备生物柴油的研究现状进行了扼要概括，探讨了固定化脂肪酶法、液体酶法和全细胞催化法制备生物柴油的最新工艺进展。

关键词：生物酶；生物柴油；固定化脂肪酶；液体酶；全细胞分类号：TQ645：TQ514 文献标识码：A 文章编号：1006－2505(2012)01－0059－03收稿日期：2011- 11- 14作者简介：郑青荷，女，在读本科生，研究方向：生物化学。

生物柴油是利用动植物油脂的低碳醇在催化剂的作用下经酯交换反应生成的脂肪酸酯[1]。

作为一种新型环保的可再生替代燃油燃料，生物柴油在近几十年来已成为学者们热衷的研究对象。

生物柴油与化石燃料相比，具有低闪点、低含硫量、温室气体净排放量为零等优势，可以替代普通柴油更为清洁、安全地使用，极具发展前景。

生物柴油的合成需要催化剂的参与，催化剂可以为酸、碱或酶。

酸催化法对原料油脂要求较高，会产生大量废酸，且催化剂难以回收利用；碱催化法要求原料酸价小于1，含水量小于 0.5%，生产工艺复杂，易皂化；相比之下，酶催化反应条件温和，对原料油脂的品质基本无要求，反应产物易分离，应用较为广泛[2]。

油脂与醇进行酯交换反应通常使用的酶催化剂为脂肪酶。

脂肪酶在自然界中来源丰富，现已能从 60 多种微生物中获取相应脂肪酶[3]。

目前商业化的脂肪酶种类繁多，主要包括 Lipase A K, Lipase P S, LipozymeRM IM, Lipase PS-30, Novozym 435等。

脂肪酶的来源不同，反应工艺往往不同。

1酶法制备生物柴油的影响因素直接影响酶法制备生物柴油转化速率的因素包括：油醇比、酶种类、酶用量、反应温度、水含量等。

反应时间不直接影响酶法制备生物柴油的转化率，但直接影响反应平衡程度和反应产物饱和度等，随着反应时间的延长，生物柴油的转化率最后趋于一定值[4]。

酶活性直接受反应体系中甲醇含量的影响。

当底物为混合物时，反应体系中甲醇的含量可适当提高。

为避免酶失活，可将甲醇分次加入。

盛梅等[5]研究固定化酶催化菜籽油与甲醇合成生物柴油的反应时发现，有机溶剂的使用可以明显改善固定化脂肪酶的活性和稳定性。

同时，分批加入甲醇可以避免一次性加入时过量甲醇对固定化脂肪酶活性的抑制作用。

李俐林等[6]用叔丁醇作为反应介质，利用固定化脂肪酶催化优质原料甲醇醇解反应制备生物柴油，消除了甲醇和甘油对酶的负面影响，酶的使用寿命显著延长。

陈志锋等[7]研究固定化脂肪酶 Novozym 435 催化高酸废油脂与乙酸甲酯酯交换制备生物柴油时发现，导致酶促交换反应速率和甲酯产率显著下降的主要原因是废油脂中高含量的游离脂肪酸与乙酸甲酯反应产生的副产物乙酸对酶有抑制作用。

此外，实验证明在反应体系中添加适量的有机碱不仅能大大提高酯交换反应速率和甲酯产率，还能显著提高固定化酶的操作稳定性。

2酶法制备生物柴油的方法与工艺2.1固定化脂肪酶法脂肪酶固定化技术具有以下特点：酶活性、稳定性高；易从产品中分离出，因此可重复使用。

固定化脂肪酶一般以硅藻土为载体，通过吸附法制备。

其中吸附法由于方法简单且成本较低，被认为是大规模固定脂肪酶的最优方法[8]。

王钰等[9]以地沟油为原料，固定化假丝酵母脂肪酶为催化剂催化转酯化反应制备生物柴油。

对所制备生物柴油的组成及物理、化学性能的检测结果体现出了生物柴油优良的特性：合成的生物柴油纯度达到了97.8%以上，精制后的产品闪点高于170 ℃，硫的质量· 59·洁、环保、高效等优点，具有很大的应用潜力。

酶法催化制备生物柴油主要有固定化脂肪酶法、液体脂肪酶法、全细胞法等方法。

然而，利用这些方法合成生物柴油的大规模应用还面临着诸多的问题与挑战。

如：原料、酶催化剂成本较高，反应条件严格，反应速率较低等，解决这些问题还需要做大量的研究工作。

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