遗传ＨＥＲＥＤＩＴＡＳ　（Ｂｅｉｊｉｎｇ）　１２　（６）：３５－３８　１９９０大麦醇溶蛋白研究概况湛小燕（中国水稻研究所，杭州３１０００６）本文综合概述了近年来大麦醇溶蛋白（Ｈｏｒｄｅｉｎ）的研究情况，涉及醇溶蛋白各组（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）多肤的含量、分子量、等电点，氨基酸组成和序列等生化特性；多肤多态性及形成机制；基因结构、定位及与其他基因（如抗白粉病基因）的连锁关系；进行多肤鉴别的一系列实验方法；蛋白质体和发育中各组醇溶蛋白多肤的积累和差异；高赖氨酸突变体（如ＲｉＳｃｐ１５０８，　ＲｉＳ（Ｐ５６）基因结构及与醇溶蛋白合成的关系等方面。根据Ｏｓｂｏｒｎｅ溶解度分类法，大麦胚乳蛋白可分成清蛋白（ａｌｂｕｍｉｎ）、球蛋白（ｇｌｏｂｕｌｉｎｓ），醇溶蛋白（ｈｏ　ｒｄｅｉｎ）和谷蛋白（ｇｌｕｔｅｌｉｎ）。其中醇溶蛋白占总蛋白的４０－６０％，是种子蛋白的重要组成部分。然而无论从必需氨基酸含量还是从氨基酸平衡看，醇溶蛋白都不理想，致使大麦营养价值偏低，影响人畜利用。因而长期以来，人们对醇溶蛋白进行了多方面的研究，包括蛋白的组成、结构及利用多态性进行品种鉴定，基因定位和遗传，蛋白质体和发育中醇溶蛋白积累，高赖氨酸突变体及与醇溶蛋白的关系等。国外研究较活跃，尤其是英国、美国和丹麦；我国起步较晚，报道不多。一、醉溶蛋白的组成、结构和多态性大麦醇溶蛋白据氨基酸组成、分子量等分为Ａ，　Ｂ，Ｃ，　Ｄ　４组。Ａ组，占总醇溶蛋白含量的１－－２％，分子量２００００道尔顿以下，等电点ｐ１５．５－７　．０，含有比Ｂ，　Ｃ组多肚明显低的谷氨酞胺、脯氨酸和相对高的赖氨酸，表现出很小或几乎没有遗传变异，并且很有可能不存在于蛋白质体［３１１，因此一般倾向于认为Ａ组多肤不是醇溶蛋白。Ｂ组是大麦醇溶蛋白的重要组成之一，占总醇溶蛋白的７０－９０％１＇１。分子量据不同测定方法有所不一，用电泳法为３５０００－４６０００道尔顿，用平衡超速离心为３２０００－３５０００道尔顿。等电点Ｐ１６．０－８．　０，富含谷氨酞胺、谷氨酸（Ｇｌｎ＋Ｇｌｕ　３５．４摩尔百分数）、脯氨酸（２０．６摩尔百分数），但比Ｃ组醇溶蛋白略低一筹；必需氨基酸和碱性氨基酸缺乏；较特殊的是相对富有含硫氨基酸（半耽氨酸２．５摩尔百分数），致使Ｂ组多肤部分以单体，部分通过二硫键以聚合体形式存在于生物体。关于Ｂ醇溶蛋白末端氨基酸的研究远落后于对Ｃ醇溶蛋白的研究。曾有人用矮肤酶双ｃａ　ｒｂｃｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ　Ｙ）水解Ｃ－端，检侧释放的氨基酸并据量与时间关系推知Ｂ，醇溶蛋白可能的序列为一Ｇ坛－Ｖａｌ－０００Ｈ，　Ｂ的Ｎ－端氨基酸分析由于不能进行埃德曼降解（Ｅｄｍａｎ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）而难以进行，未见报道．Ｃ组，占总醇溶蛋白的１０－３０％，分子量５５００。一７５０００道尔顿（ＳＤＳ一ＰＡＧＥ）或５２０００道尔顿（平衡超速离心），等电点ｐＩ５．０－６．０。富含谷氨酚胺、谷氨酸（Ｇｌｎ＋Ｇｌｕ　４０摩尔百分数）、脯氨酸（３０摩尔百分数），缺乏必需氨基酸和酸或碱性氨基酸，赖氨酸和蛋氨酸含量比Ｂ醇溶蛋白还低，平均每条多肤链仅１个赖氨酸残基。与Ｂ不同的是没有或痕量半肤氨酸，多肤一般以单体形式存在；但也有人〔１３’认为Ｃ组各多肤可能相互或与其他醇溶蛋白多肤以氢键或疏水作用而聚合，这种聚合在提取过程中被破坏了。Ｃ组内各多肤有较高的结构同源性〔”’，Ｎ－端３０个残基仅１个有替代，１２个残基后是３个重复序列（ｐｒｏ／Ｌｏｕ－Ｇｌｎ－Ｇｌｎ－ｐｒｏ－Ｔｙｒ）ｏ　２个随机糜蛋白酶切序列是八肤（ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｇｌｎ－ｐｒｏ－ｐｈｅ－ｐｒｏ－Ｇ１ｎ－Ｇｌｎ）。由于苯丙氨酸可替代酩氨酸，这八肤可能是５肤加３队。另有人‘川以ＲｉｓＯ　５６测定的Ｎ－端序列为Ｚｈａｎ　Ｘｉａｏｙａｎ：　ＡＨｏｒｄｅｉｎ　ｏｆ　Ｂａｒｌｅｙ本文于１９８９年５月Ｓｕｒｖｅｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ２７日收到。综迷ＰＱＮｐｙｆ１（ａ．．．．．．　ｆ表示预测的９－折叠）用拨肤酶Ｙ水解法测定Ｃ－端，认为Ｃ，多肤可能有２类，即一Ｖａｌ一Ｓｅｒ－０００Ｈ和一Ｌｌｅ－Ｍｅｔ－０００Ｈ。关于Ｃ醇溶蛋白二级结构，不少人认为〔．，‘书，”’是Ｒ－折叠。没有“一螺旋和（３－片层，是由于脯氨酸的存在，在Ｎ－端，每隔２，３，４个残基就出现１次脯氨酸，而形成。－螺旋或Ｒ－片层的最小残基数分别为５，６０Ｄ组，占总醇溶蛋白的２－４％，分子量１００　０００以上，Ｐ１８．０左右，含有较多甘氨酸。品种间变异很小，单向电泳仅具一条带，但双向电泳或其他高分辨率方法表明它包含了若干等电点不同的多肤，并可能以聚合的形式存在于生物体。众多证据表明〔ｚ４１　Ｂ和Ｃ组醇溶蛋白有极明显的多态性，多肤数Ｂ至少三四十个，Ｃ至少一二十个，每种多肤在品种和地理上的分布有差异，同一组内各多肤分子量、等电点等不同，却有相似的氨基酸组成和末端氨基酸序列〔川。对这些现象目前一般认为编码Ｂ，Ｃ醇溶蛋白的Ｈｏｒ２，　Ｈｏｒｌ位点是多基因簇，由一原给基因经重复、趋异形成的紧密连锁基因群Ｅ４，９１。由于醇溶蛋白不承担重要生理功能，可以忍受较多突变，故有明显的多态性。点突变、缺失和／或插入可能对多态性起作用，除了造成等电点和溟化氰断裂型改变，后者通过不对等交换或对错误配对ＤＮＡ的修正，改变了多肤分子量。这些趋异途径也可解释同组多肤有不同的等电点和分子量却有相似的末端氨基酸序列。有研究表明组内各多肤在序列同源程度上表现出差异，这可能暗示重复、趋异是在长时期内分几次发生的。可能由于检测方法限制和等位基因剂量效应干扰，Ｈｏｒ　１，Ｈｏｒ２，　Ｈｏｒ３位点内部未见重组报道，而这种重组在决定不同多肤在现代大麦系列中的分布可能起到了重要作用。二、醇溶蛋白基因定位及遗传醇溶蛋白各组多肤基因及定位长期以来颇受重视。一致认为Ｈｏｒ　１，　Ｈｏｒ　２，　Ｈｏｒ　３位于第５染色体。较完整连锁图是Ｊｅｎｓｅｎ＂＇３和Ｓｈｅｗｒｙｒ３＝〕提出的（图１）０、短臂、长臂Ｈｏｒ　１　Ｃ醇溶蛋白Ｈｏｒ　２　Ｂ醇溶蛋白月ｏｒ　３　Ｄ醇溶蛋白图１大麦第５染色体部分基因连锁图Ｒｐｓ４　（Ｙｒ４）抗黄锈病１共显性Ａ里Ｉｎ俘召抗白粉病黑果皮显性ｎｅｃｌ叶上坏死点ｒｕｓｔｓ幼叶白条斑了ｓ２脆茎隐性二者结果基本相似，但Ｈｏｒｌ－Ｒｐｓ４间图距相去甚远，分别为１．５ｃｍ和１５．９ｃｍ，原因不明。Ｓｈｅｗｒｙ认为Ｍｉｎ，与Ｈｏｒ３，　Ｈｏｒｌ，　Ｒｐｓ不连锁，但Ｊｅｎｓｅｎ以为Ｍｉｎ。与二。１间有松散连锁（３６．８　ｆ　４．２）；现有倾向认为Ｍｉｎ。可能并不真正位于第，染色休，有待进一步证明。另据报道Ｅ３０１，抗白粉病基因Ｍｉａ，　Ｍｌｌ。与Ｈｏｒｌ，　Ｈｏｒ２连锁。Ｈｏｒｌ，　Ｈｏｒ２间距０．１６１＋０．０２６ｃｍ，　Ｍ１ａ位于之间，跟Ｈｏｒ　１，　Ｈｏｒ　２间距０．０６４士０．０２０和０．０８２　ｆ　０．０２４ｃｍｏ　Ｈｏｒｌ，　Ｈｏｒ２和Ｍｌａ，Ｍｌｌｅ的紧密联锁，客观上造成某些抗白粉病基因与特定醇榕蛋白等位基因联合，在一些情况下，育种中引进抗白粉基因，同时也就把某些醇溶蛋白等位基因引进来。这一连锁，意味着醇溶蛋白分析可作为抗白粉病育种的初级检测Ｃ２６７０从杂交子二代分离看，Ｈｏｒｌ，　Ｈｏｒ　２，Ｈｏｒ　３均为１：２：１　（Ｐ＞０．０５），表明是共显性遗传。比较大麦醇溶蛋白基因位置与相应基因在小麦上的位置是很有意义的（图２）。小麦高分子量型蛋白丈ＨＭＷ）由等位基因Ｇｌｕ　１编码，位于第１同源染色体长臂，距着丝粒９ｃｍｒ２３１。大麦第５染色体着丝粒可能位于ｆｓ２的短臂端，这样，Ｈｏｒ３距着丝粒大约也是９ｃｍ。小麦ｗ一型醇溶蛋白与ｃ组同源，由Ｇｌｉ　１编码，在第１染色体短臂，距Ｇｌｕｌ　６６ｃｍ，与Ｈｏｒｌ和Ｈｏｒ３短臂长肴ＧｌｉＧｌｒ．小麦第Ｉ同源桑色体（１Ｂ染色体）小麦第５染色体Ｈｏｒ２　ＨｏｒｌＨｏｒ３图２醇溶蛋白基因在大、小麦染色体上位置比较的间距（６４．８士３．３ｃｍ）很接近。小麦ｒ一型醇溶蛋白与Ｂ组多眯氨基酸组成相似，由Ｇｌｉ　１编码；这样，小麦Ｇｌｉ　１可能对应于大麦的Ｈｏｒ　１和Ｈｏｒ　２。小麦醇溶蛋白基因Ｇｌｉ　２在第６同源染色体短臂「”，，，，。三、利用醇溶蛋白多态性进行品种鉴定不同种与品种醇溶蛋白并不完全相同，构成了差异。由于多肤是基因产物，因而特征多肤是相对稳定的；虽然环境因子可影响蛋白含量，但特征多肤的有无全然不受影响，这样，醇溶蛋白就成为品种的标记或“指纹”，）一与泛应用于品种或种的鉴定。分离各醇溶蛋白多肤的方法有电泳，包括早期使用的淀粉凝胶电泳（ＳＧＥ），尿素一聚丙烯酞胺凝胶电泳（ｕｒｅａ－ＰＡＧＥ）和目前广为使用的十二烷基磺酸钠一聚丙烯酚胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ），等电聚焦凝胶电泳（ＩＥＦ）及双向电泳。随着生物技术的不断更新，目前多采用高效液相柱层析，其中用得最多的是反向高效液相柱层析（ＲＰ－ＨＰＬＣ），不仅加快了分析速度，结果还可自动分类，鉴别出一些电泳无法甄别的相似品种〔ｅｔｏ　Ｂａｔｅｇｔ＇３提出的离子交换柱层析也可快速而精确地分离多肤，而所需设备比较简单，Ｄｅｉｃｈｌ和Ｄｏｎｈａｕｓｅｒｔｔ０，ｒｚ］发展了定量免疫法，即以醇溶蛋白多肤为抗原的抗原抗体反应，可以定量，检测到一些不易区分的品种；并且构建的单克隆抗体有可能允许在短时间内检测大量样品。如果说上述方法是以多肤为目标，那么Ｂｕｒｒ和Ｒｉｖｉｎｔ５，＇，ｚ＇３提出的方法是直接对准了基因。他们以醇溶蛋白基因ＤＮＡ限制性酶切片段长度的多态性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ＲＦＬＰ＇ｓ）为指纹，即以ＤＮＡ限制性核酸内切酶（Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ和Ｅｃｏ　Ｒ１）酶切Ｈｏｒ　１，　Ｈｏｒ　２，　Ｈｏｒ　３，再通过吸印转移法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ），用Ｃ，　Ｂ，　Ｄ醇溶蛋白ｃＤＮＡ克隆与酶切片段杂交，差异表现为杂交片段数目和／或电泳迁移率不同，达到鉴定目的。四、蛋白质体和发育中醇溶蛋白积累虽然一直认为醇溶蛋白和球蛋白沉积于蛋白质体，但细节不清。至１９８１年，Ｍｉｆｌｉｎｔｚ”指出：大麦醇溶蛋白在粗糙内质网合成并聚集成团，然后从内质网破出，形成不规则沉淀体（蛋白质体），其表面没有完整的膜，但有许多小泡，并与粗糙内质网仍有粘连。据Ｒａｈｍａｎｔｚ＝’观察，大麦受精后胚乳发育远比胚早，１４天胚乳液状体，１８天电泳检测不到特征带型，但此后醇溶蛋白合成迅速增加，２０天胚乳达干重的４０％，可见电泳带型，２２天胚乳已达干重的“％。在发育过程中，幼小胚乳时Ｃ达到高峰，约占总醇溶蛋白的２０％，但渐减至２６天的１４％，并稳定下来；相应观察到Ｂ：的增加，从幼小组织的３０％到成熟种子的５０％。由此可见，Ｈｏｒ　２，Ｈｏｒ　１的表达是有差异的「“’。另外，若硫成为限制因子，也将导致Ｂ，　Ｃ比例的改变，因为合成Ｂ醇溶蛋白需要含硫氨基酸，而Ｃ组多肤几乎不含半胧氨酸，籽拉发育过程中Ａ的相对量也渐减。值得注意的是组内各多肤积累速率也有差异，如Ｂ组，Ｂ１相对增加，而这种增加不可能是其他Ｂ组分转化造成的。因为一方面从澳化氰切带型看，Ｂ１有二个高等电点多肤，它们与Ｂ２，Ｂ３的多肤明显不同；另一方面，检测到ｍＲＮＡ的变化与之吻合‘”’产ＤＮＡ克隆杂交也证明之。这意味着同一复合基因簇的表达有所不同，而这一基因簇很可能受律动调节（ｃ。一ｏｒｄｉｎａｔｅｄ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）的。但也有人认为这是由于ｍＲＮＡ稳定性不同造成的。五、大麦高赖氨酸突变体及其与醇溶蛋白的关系最初，人们在玉米中发现了高赖氨酸突变体，随后，在大麦、高粱等作物中也陆续有了发现。大麦有１８种突变体或系列，其中部分进行了遗传分析和基因定位，主要涉及的染色体有第１，５，６，７号。Ｒｉｓ（１５０８的醇溶蛋白量比亲本（Ｂｏｍｉ）明显减少〔１９，３４１，有证据表明这并非合成起始晚，而是合成的抑制或减少；电泳带型也发生了变化〔”。清蛋白含量显著增加。Ｒｉｓ（　１５０８高赖氨酸基因ｌｙｓ　３ａ位于第７染色体，在调节醇溶蛋白合成时对不同组多肤有不同效应，分别为：Ｄ不受影响；Ｃ几乎完全抑制，对ＢＩ影响较大，对Ｂ３有影响但小于前者。在相关的ｍＲＮＡ上也看到了这种表象６值得注意的是Ｒｉｓ中１５０８中并未发现Ｈｏｒ　２位点的严重缺失（对比Ｒｉ呻５６）ｏ　Ｂ１和Ｂ３的相对比例也受另二个突变基因的影响，它们是Ｒｉｓ（　１３第６染色体上的ｌｙｓ５ｆ和Ｒｉｓ（　７的未定位高赖氨酸突变基因。所有这些突变基因可以认为是调节者，可位于也可不位于第５染色体。这些基因可能还存在多效效应（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ　ｅｆｆｅｃｔｓ）．