・２４５８・ 广东医学２０１３年８月第３４卷第１６期 Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｕｇ．２０１３．Ｖｏ１．３４．Ｎｏ．１６
家蝇Ｄｅｆｅｎｓｉｎ基因原核表达条件的优化及其
抑菌活性
许琴英 ，朱家勇 ，金小宝。，徐建华
。广东医学院寄生虫学暨临床寄生虫检验学教研室（广东湛江５２４０２３）； 广东省生物活性药物研究重点实验室
（广州５１０００６）
【摘要】 目的优化家蝇Ｄｅｆｅｎｓｉｎ基因原核表达条件，并初步研究其抑菌活性。方法Ｄｅｆｅｎｓｉｎ基因成熟肽
被克隆入ｐＧＥＸ一４Ｔ一１原核表达载体中，构建重组质粒ｐＧＥＸ一４Ｔ一１／Ｄｅｆｅｎｓｉｎ，并转化宿主菌后诱导表达，表达
过程中对茵液起始浓度、ＩＰＴＧ浓度、诱导温度和时间进行优化。采用亲和层析法分离纯化融合蛋白．ＳＤＳ—ＰＡＧＥ
鉴定目的蛋白的表达情况和分子量。用凝血酶切除谷胱甘肽标签，并通过体外抑茵实验检测其抗茵活性。结果
成功构建重组质粒ｐＧＥＸ一４Ｔ一１／Ｄｅｆｅｎｓｉｎ，目的基因能够在大肠埃希菌内高效表达，分子量为４ ｋＤ，与预期值
一致，表达量约达４０％。抑茵实验显示其对大肠埃希茵Ｋ Ｄ 生长有一定的抑制作用。结论 本实验为家蝇
Ｄｅｆｅｎｓｉｎ基因功能的深入研究奠定了工作基础。
【关键词】抗茵肽；表达；活性；Ｄｅｆｅｎｓｉｎ
昆虫防御素（Ｄｅｆｅｎｓｉｎ）是一类碱性小分子多肽，具
有热稳定性强、诱导源的非专一性和抗菌谱广等特点，
有望开发成一类新型的多肽抗生素 。由于其在组
织中含量低，分离获得大量的天然产物很困难，而人工
合成多肽的成本高，限制了其应用前景。因此，利用基
因重组技术克隆表达基因是获取昆虫抗菌肽的理想途
径。大肠埃希菌表达系统是最常用的基因工程表达系
统，研究者已利用该系统表达了多种蛋白。２００５年１
月至２００７年１２月，本研究在实验室已构建的含有家
蝇幼虫Ｄｅｆｅｎｓｉｎ基因的重组质粒ｐＵＣｍ—Ｔ／Ｄｅｆｅｎｓｉｎ
的基础上 ，将家蝇幼虫Ｄｅｆｅｎｓｉｎ基因克隆入原核表
达载体，对其表达条件进行优化，并对表达产物进行抑
菌活性的研究。
１材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 受体菌与载体 大肠埃希菌ＤＨ５ｃ￣、ＢＬ２１
（ＤＥ。）和ｐＵＣｍ—Ｔ／Ｄｅｆｅｎｓｉｎ重组质粒为广东省生物
活性药物研究重点实验室保存，原核表达载体ｐＧＥＸ一
４Ｔ一１购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。
１．１．２主要试剂 本实验所用分子生物学相关试剂
均购自ＴａＫａＲａ公司；ＰＶＤＦ膜、蛋白质标准分子质量
为华美生物公司产品；丙烯酰胺、Ｎ，Ｎ 一亚甲叉双丙
烯酰胺、考马斯亮蓝、氨苄青霉素和卡那霉素、羊抗小
鼠ＩｇＧ２过氧化物酶、小鼠抗ＧＳＴ单抗等为北京鼎国生
物工程有限公司产品；ＧＳＴｒａｐ。。 ＦＦ和ＨｉＴｒａｐ Ｂｅｎｚａｍｉ．
ｄｉｎｅ ＦＦ（ｈｉｇｈ ｓｕｂ）为Ａｍｅ￣ｈａｍ公司产品。
１．２ 方法
１．２．１ 引物的设计与合成根据Ｇｅｎｂａｎｋ公布的家
蝇成虫Ｄｅｆｅｎｓｉｎ基因（登陆号：ＡＹ２６０１５２），设计特异
△通信作者。Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｕｊｙ＠ｇｄｐｕ．ｅｄｕ．ｃａ 弓Ｉ物Ｐｍｌ（５ 一ｃｇｃｇｇａｔｃｃｇｃｔａｃｔｔｇｃｇａｔｔｔｇｔ一３ ，含ＢａｍＨ Ｉ
酶切位点）和Ｐｍ２（５ 一ｃｇｃｔｃｇａｇａｃａｃｃｔｃａｇｔｔａｃｇｇｃ一３ ，含
Ｘｈｏ Ｉ酶切位点），拟扩增家蝇幼虫Ｄｅｆｅｎｓｉｎ基因的编
码序列。引物由北京三博合成。
１．２．２ 家蝇Ｄｅｆｅｎｓｉｎ基因原核表达质粒构建 以
ｐＵＣｍ—Ｔ／Ｄｅｆｅｎｓｉｎ重组质粒为模板，以Ｐｍｌ、Ｐｍ２为引
物进行ＰＣＲ，扩增家蝇幼虫Ｄｅｆｅｎｓｉｎ基因的序列；扩增
产物纯化后以ＢａｍＨ Ｉ和Ｘｈｏ Ｉ对其进行酶切；此酶
切产物再与经ＢａｍＨ Ｉ和Ｘｈｏ Ｉ酶切后的ｐＧＥＸ一
４Ｔ一１原核表达载体连接，构建重组质粒ｐＧＥＸ一４Ｔ一
１／Ｄｅｆｅｎｓｉｎ。此重组质粒经测序正确后转化大肠埃希
菌ＢＬ２１（ＤＥ ），筛选阳性表达菌。
１．２．３ ｐＧＥＸ一４Ｔ一１／Ｄｅｆｅｎｓｉｎ重组质粒表达条件的优化
参照文献［４］的方法，挑取含有重组质粒ｐＧＥＸ一４Ｔ一
１／Ｄｅｆｅｎｓｉｎ的ＢＩ２１（ＤＥ ）单菌落进行培养，检测目的
基因在不同条件的表达水平。（１）菌液的起始浓度不
同（０Ｄ 为０．４、０．６、０．８、１．０）。（２）ＩｌＹＦＧ的诱导终浓
度不同（０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２ ｍｍｏｌｆＬ）。（３）在
同一ＩＰＴＧ的浓度下，培养温度不同（２８℃、３０℃、３５℃、
３７￣Ｃ）。（４）在同一ＩＰＴＧ的浓度下，培养时间不同（２、
４、６、８ ｈ）。对上述实验菌液各取１ ｍＬ经１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ
离心去上清处理后，进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，分析目的
蛋白的表达量，以确定最佳原核载体的表达条件。具
体操作参照文献［４］：４％浓缩胶，１５％分离胶。
１．２．４表达产物的的可溶性分析挑取一个ｐＧＥＸ一
４Ｔ一１／Ｄｅｆｅｎｓｉｎ单菌落加入到５ ｍＬ ＬＢ液体培养基中，
３７℃，２８０ ｒ／ｍｉｎ振摇８～１２ ｈ。将此菌液按１：１００比例
接种到新鲜的抗性ＬＢ液培中，在以上筛选优化的诱导
条件下表达后，用化学和超声方法裂解细菌，对表达产
物进行可溶性分析。将诱导前后对照、上清液和沉淀
物样品处理后进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，
检测融合蛋白的 广东医学２０１３年８月第３４卷第１６期 Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ ＪｏｕｒｎＭ Ａｕｇ．２０１３，Ｖｏ１．３４，Ｎｏ．１６
Ｄｅｆｅｎｓｉｎ在ＢＩ２１（ＤＥ ）内的表达量的最佳条件，但表
达蛋白大部分形成包涵体。为防止表达蛋白形成包涵
体，对诱导表达时的条件作了调整，发现较低的ＩＰＴＧ
浓度（０．４ ｍｍｏｌ／Ｌ）、低温（３０￣Ｃ左右）诱导表达时间６ ｈ
的重组蛋白主要在破菌后的上清中，以可溶性形式表
达，薄层扫描分析的结果表明重组蛋白约占菌体总蛋白
的４０％。发现在高表达量的同时可得到大量高效表达
的可溶性蛋白，这为蛋白的纯化带来很大的方便。
本研究可溶形式存在的表达产物可用ＧＳＴｒａｐ ＦＦ
进行亲和层析柱纯化，其成分Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ
是由载体琼脂糖一４Ｂ与配基ＧＳＴ偶联而成的，配基
ＧＳＴ可以特异性结合带有ＧＳＴ标记的融合蛋白，最后
用还原型的ＧＳＴ可以温和地把带ＧＳＴ标记的融合蛋
白洗脱下来。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析，显示纯化获得较满意
效果。融合蛋白在较高的浓度下，表现出对大肠埃希
菌生长的抑制，说明融合蛋白具有部分抗菌活性，可利
用该特性，在体内检测Ｄｅｆｅｎｓｉｎ的活性。但ＧＳＴ标签
分子量大，对目的蛋白理化性质影响大，采用凝血酶酶
切ＧＳＴ，去除可获得天然的目的蛋白。而抑菌活性试 ・２４６１・
验表明，纯化后的Ｄｅｆｅｎｓｉｎ蛋白具有一定的抑菌活性。
参考文献
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Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ，２０１０，３９３（２）：２９０—２９６．
（收稿日期：２０１３—０４—２６编辑：朱绍煜）
血液透析治疗老年硬膜下出血尿毒症患者１例
范立明，钟先阳，童俊容，张虹
广州军区广州总医院肾脏内科（广州５１００１０）
患者，男，８３岁，因发现血肌酐升 高２年余，突发左侧肢体乏力４ ｄ于 ２０１２年９月１２日入院。２０１０年发现
血肌酐升高，一直服用中药治疗，血肌
酐波动在２００～２５０￣ｍｏｌ／Ｌ之间；２０１２
年７月人我科住院治疗，查肾功能提示 ＢＵＮ ２２．７ ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｓｃｒ ３７８ ｐ．ｍｏｌ／Ｌ，ＣＣｒ
１３．２ ｍｌＭｍｉｎ，诊断为慢性肾功能衰竭，
给予护肾排毒、降压等处理，并行左前
臂动静脉内瘘术后出院，未行透析治
疗；２０１２年９月８日出现左侧肢体乏
力，伴头痛，自行服药效果差。发病以
来患者尿量正常，双下肢无水肿；体格 检查：ＢＰ １６５／７０ ｍｍＨｇ，慢性病容，心
肺无明显异常，口角左歪，左侧肢体肌
力＋＋＋，右侧肢体肌力＋＋＋＋；病理
征未引出。检查结果：’肾功能：ＢＵＮ：
４０．０ ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｓｃｒ ６４１￣ｍｏｌ／Ｌ，电解质：
Ｋ：６．９ ｍｍｏｌ／Ｌ，血常规提示：ｌｉｂ ６９ ｇ／Ｌ，
Ｐｌｔ：９５×１０ ・Ｌ～；颅脑ＣＴ提示右侧颞
顶部硬膜下出血。诊断（１）慢性肾功能
不全尿毒症期；（２）右侧颞顶部硬膜下
出血；（３）高钾血症。经与患者及家属 沟通并征得同意签字后，给予行血液透
析治疗，同时给予降压、纠正贫血及对
症处理。透析方案：予碳酸氢盐透析
液，左前臂动静脉内瘘为血管通路，无
肝素透析，先安排３次诱导透析，诱导
透析期间血流量波动在１５０—２５０ ｍＬ／ ｍｉｎ之问，未脱水，诱导透析３次后改
行规律血透，透析过程中嘱患者避免情
绪激动。
诱导透析第３次时，患者出现四肢
抽搐，牙关紧闭，持续约５０ Ｓ，立即给予
停止透析，静脉滴注甘露醇等处理，之
后多次发作四肢抽搐，请神经内科会
诊，急诊复查颅脑ＣＴ硬膜下出血与前
大致相仿；请神经外科医生会诊，考虑
硬膜下出血量少，脑组织无明显受压，
中线居中，脑室脑池未见受压，暂无手
术指征。神经内科会诊后考虑症状性
癫痫，给予口服卡马西平、肌肉注射苯
巴比妥钠等处理后症状逐渐好转；之后 继续无肝素透析，患者未再发作癫痫，
１１月５日复查颅脑ＣＴ提示硬膜下出
血量较前减少。现仍在规律透析治疗
中，患者一般状况尚可。
讨论尿毒症患者由于长期存在
高血压、糖尿病等基础疾病，终末期。肾
病自身代谢紊乱，加重血管硬化，同时
由于尿毒症毒素蓄积导致血小板功能 异常和凝血缺陷，加上肾性贫血可减低
血液黏稠度，影响血小板与血管壁接触
而加重出血倾向。血液透析由于透析
膜的作用可使血小板膜受体改变和破
坏，从而影响血小板和血管壁及血小板
之间的相互作用，出血倾向更加明显。
心脑血管疾病是慢性肾功能衰竭患者 最常见和最严重的并发症，颅内出血是
少见但致命的并发症。
血液透析本身血流动力学不稳定
会引起血压波动和液体失衡加重脑出
血的可能，尿毒症合并脑出血一般认为
血液透析的严格禁忌证或相对禁忌证，
目前认为合并脑出血患者较容易耐受
者首先为腹膜透析。
该患者我们在治疗过程中，选用无
肝素血液透析，经治疗后症状明显好
转，无脑出血增加。我们的体会是对于
尿毒症合并脑出血患者，请神经相关科
室会诊排除手术指征后，可以给予普通
血液透析治疗，透析方案的选择上，抗
凝方案选择无肝素透析，透析频次方面
建议诱导透析逐步过渡到规律血透，诱 导透析过程中注意预防透析失衡加重
脑出血，可给予甘露醇静脉滴注处理，
透析膜选择上注意选择生物相容性好
的透析膜减少出血风险，同时透析过程
中注意监测生命体征变化，另外避免患 者情绪波动，复查患者凝血功能等。当
然，由于该患者尿量正常，透析过程中
未脱水，对血流动力学影响相对较小，
相对减少了脑出血的风险，对于尿毒症
患者合并脑出血的普通血液透析安全
问题及透析过程中需要关注的问题还
需要大样本临床数据去证实。
（收稿日期：２０１２—１１—１９编辑：庄晓文）