http://www.paper.edu.cn - 1 - 环氧化酶2(COX-2)基因功能多态性与中国人群乳腺癌危险性关系的研究1

高君1，柯巧1，马红霞1，王艳1，胡志斌1，翟祥军1，王雪晨2，秦建伟3，陈文森1，靳光付1，刘继勇1，王心如1，魏庆义4，沈洪兵1

1南京医科大学流行病与卫生统计学系，南京（210029） 2南京市鼓楼医院外科，南京（210008） 3江苏省肿瘤医院乳腺外科，南京（210009） 4 M. D. Anderson肿瘤中心流行病系，休斯顿（77030） E-mail：hbshen@njmu.edu.cn 摘 要：环氧化酶（Cyclooxygenase）是前列腺素（Prostaglandins，PGs）合成的限速酶，至少有两种同工酶, 即COX-1和COX-2。在肿瘤发生中起着重要作用，COX-2过度表达能够促进细胞增殖、抑制凋亡和促进乳腺癌细胞侵袭。COX-2功能性多态改变可能改变个体对乳腺癌的易感性。本研究中对COX-2的三个多态位点(启动子区的-1195G/A、-765G/C和in 3’UTR区的8473C/T)与中国人群乳腺癌遗传易感性的关系进行了研究。我们的病例对照研究中包括615例病理学明确诊断的乳腺癌病例和643例无癌对照，以年龄进行频数匹配。Logistic回归分析显示， COX-2三个多态性位点单位点分析未发现与乳腺癌危险性的关联。但是，以携带0-3个突变等位基因者为参照，我们发现携带3个以上突变等位基因的个体患乳腺癌的风险显著增加（调整OR =1.36，95%CI=1.01-1.83）。单倍型分析发现与常见的单倍型G-1195G-765T8473相比单倍型A-1195G-765T8473和A-1195C-765T8473可以显著提高个体患乳腺癌的

风险（OR值及95%可信区间分别为1.20（1.01-1.43）和9.16（1.14–73.51））。研究结果提示提示COX-2基因调控区域的这三个单核苷酸多态可能参与乳腺癌的病理进程。 关键词：环氧化酶2（COX-2），基因多态性，乳腺癌，分子流行病学 中图分类号：R18

1．引言 环氧化酶（Cyclooxygenase ，COX）也叫做前列腺素内过氧化物合酶（prostaglandin endoperoxide synthases ，PTGs），是花生四烯酸代谢过程中前列腺素合成的限速酶。前列腺素（Prostaglandins，PGs）在多种生理和病理进程中发挥了重要作用，包括：炎症、细胞增殖和血管生成等，这些在肿瘤的发生发展中也起了关键性作用[1-3] 。COX至少有两种同工

酶, 即COX-1和COX-2。COX-1是结构型酶，体内大多数影响PG合成的正常组织都可表达。而COX-2是诱导型酶，在大多数正常组织中都不表达，但在生长因子、细胞因子、内毒素、激素、促肿瘤剂及癌基因等多种刺激因素的作用下可迅速诱导其表达[4-6]。COX-2过度表达能够促进细胞增殖、抑制凋亡和促进新生血管生成[2,7-8]。近年来研究发现，COX-2在多种肿

瘤中呈过度表达[9-13]， 包括乳腺癌[14-16]。Denkert等[17]报道COX-2过度表达与乳腺癌的淋巴结转移、低分化程度、肿瘤大小有关。另外，众多研究包括流行病学研究[18-20]和动物实验[21,22]

证明了定期服用非甾体类抗炎药（NSAIDs）能够预防乳腺癌的发生，其主要机制通过抑制COX-2的作用。 转录水平上的调控是COX-2基因调控表达和稳定性的主要机制[23]。Mestre等[24,25]报道

COX-2基因的启动子区包含了多种转录因子结合位点，例如：CRE（cAMP应答启动子元件）以及Sp1、NF-κB、c-MYB等因子结合位点。因此， COX-2基因启动子区的多态性改变可能潜在地影响某种因子的结合，改变基因的转录活性，进而影响环氧化酶的表达[26-28]及肿瘤的

1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（20040312006）的资助。 http://www.paper.edu.cn - 2 - 发生。张雪梅等[28]发现，在COX-2基因启动子区-1195G→A的多态性改变产生了一个c-MYB转录因子结合位点，增强了COX-2基因的转录活性。并且在中国人群的病例对照研究中证实了-1195G/A和启动子区的另一个单核苷酸多态-765G/C与食管癌的遗传易感性密切相关。有研究 [26.27]认为启动子区的-765G/C是一个潜在的功能性位点，G→C的突变消除了一个Sp1结

合位点，但是产生了一个E2F结合位点，进而导致环氧化酶2表达的增加或减少。另外，有研究表明鼠类COX-2基因的33’端非编码区含有一些调控序列，可以改变mRNA的稳定性以及翻译效率[29] ，因此这对于mRNA的降解、稳定和翻译很重要[30]。所以，COX-2基因的3’端非编码区的多态改变可能会改变调控因子的亲和力而影响COX-2的表达，进而影响个体对癌症（包括乳腺癌）的易感性 [31-33]。

在本研究中，我们假设COX-2基因的启动子区两个多态(-1195G/A、-765G/C)和3’端非编码区的单核苷酸多态(8473C/T)可能单独或/和联合与乳腺癌的遗传易感性有关。为了验证这个假设，我们通过病例对照研究（615例乳腺癌病例和643例频率匹配的无癌对照），对COX-2 -1195G/A、-765G/C和8473C/T三个多态性与中国人群乳腺癌遗传易感性的关系进行研究。

2．材料和方法 2.1 研究对象 研究包括615例乳腺癌病例和643例频率匹配的无癌对照。病例为2004年1月至2005年3月在江苏省人民医院、江苏省肿瘤医院、南京市鼓楼医院、东南大学附属中大医院收治的新发乳腺癌患者。所有患者都为无亲缘关系的南京市及其周边地区汉族人群，经病理组织学确诊。剔除标准包括既往癌症史，其他组织转移癌症和有既往放⁄化疗史。对照是从江苏省社区慢性非传染性疾病筛查的人群（共10,500个对象）中随机挑选的，根据病例的城乡（城市或农村）和年龄（±5岁）分布进行频数匹配，为无乳腺肿瘤和其它肿瘤患病史的健康女性。研究对象签署知情同意书后，由经过统一培训的调查员使用统一的调查表，对全部调查对象进行面访问卷调查，内容包括一般情况、月经及生育史、与生殖相关的生活方式、环境暴露史和一级亲属肿瘤家族史（父母、同胞和孩子）。调查后，每位研究对象提供5ml的静脉血液标本。

2.2 基因型检测 染色体DNA是从外周血白细胞中提取的,按照蛋白酶K消化然后酚－氯仿提取和乙醇沉淀的标准程序。参照文献[28,34]设计COX-2 -1195G/A、-765G/C 和8473C/T的扩增引物，序列如下: −1195G/A F, 5′-ccctgagcactacccatgat-3′, R, 5′-gcccttcataggagatactgg-3′; −765G/C F, 5′-tattatgaggagaatttacctttcgc-3′, R, 5′-gctaagttgctttcaacagaagaaat-3′; and8473C/T F, 5′-gtttgaaattttaaagtacttttgat-3′, R, 5′-tttcaaattattgtttcattgc-3′. 20µlPCR扩增反应体系包括：约50 ngDNA、12.5 pmol引物、0.1 mM dNTP、 1 × PCR buffer (50 mM KCl,10 mM Tris-HCl和0.1% Triton X-100, pH 9.0,) and 1 U Taq酶。8473C/T位点的MgCl2浓度是1.8 mM，而−1195G/A和

-765G/C的是1 mM。PCR扩增循环包括95°C预变性5min，接着进入循环；95°C变性30s；然后按COX-2 -1195G/A、-765G/C 和8473C/T位点，分别以61°C、54°C及53°C退火40s; 接着72°C延伸45s，2-4步骤循环35次后72°C延伸10min。分别用内切酶PvuII, HhaI和BclI (New England BioLabs, Beverly, MA)来辨别−1195G/A,−765G/C和8473C/T基因型。虽然一些基因型缺失或者由于某些DNA质量和⁄或数量问题导致分型失败，但是每个位点仍然达到了95%的应答率。最终，本研究成功获得601例乳腺癌病例和643例对照的三个多态性位点的所有基因http://www.paper.edu.cn - 3 - 型。 2.3 统计方法 采用χ2 检验（分类变量）或/和t 检验（连续变量）比较病例和对照间人口学特征、乳

腺癌发病相关因素及COX-2多态位点变异等位基因频率的分布，采用单因素和多因素logistic回归分析计算优势比（odds ratio, OR）及其95%可信区间（confidence interval, CI）表示各多态性位点变异基因型与野生纯合型比较致乳腺癌的相对危险度。采用分层分析法控制混杂因素对分析结果的影响。采用拟合优度χ2 检验计算对照组的基因型分布是否符合

Hardy-Weinberg平衡，采用PHASE 2.0 软件推算COX-2三个多态位点单倍型频率在病例和对照组中的分布。所有的统计检验均为双侧概率检验，P<0.05为差异有统计学意义。所用统计软件为SAS9.1.3版。

3．结果 研究对象的一般特征如表1所示。病例组和对照组的平均年龄差异无显著性。病例组的月经初潮年龄显著低于对照组，而首胎活产年龄则显著高于对照。而且产次、流产和肿瘤家族史在病例组和对照组之间的分布差异有显著性（表1）。 COX-2 -1195G/A、-765 G/C 及8473C/T各种基因型在病例组和对照组中的分布见表2。在对照中，三种多态性基因型的频率分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。单位点分析中，三个多态性位点各基因型的频率在病例组和对照组中的分布都无统计学显著性差异。多元logistic回归分析显示COX-2 -1195G/A, −765G/C和8473C/T多态性与乳腺癌危险性存在剂量反应关系，与野生基因型相比，−765GC/CC是1.38和8473CT/TT是1.05(如表2)。我们对三个多态性位点进行了联合分析，以携带0-3个突变等位基因者为参照，发现携带3个以上突变等位基因的个体患乳腺癌的风险显著增加。 如表3所示，根据COX-2已知的3个位点的基因型可以推断出8种单倍型。其中单倍型A-1195G-765T8473和A1195C-765T8473在病例组中的频率(分别为0.37和0.007)显著高于对照组