初步测定 抗体特性
CoMFA
预测抗体 三维结构
Docking
3D-QSAR 获取兽药-抗体互 作主要力场 推测兽药-抗体间 发生作用的 氨基酸性质 重组抗体定向改造
互作模型
获取兽药-抗体互 作结构信息
推测兽药-抗体间 发生作用的 氨基酸位点
受体抗体（Acceptor）
受体作为特异性识别的生物大分子，因其分离纯化及体外 构建均较复杂，应用于免疫分析的报道很少 UniSenesor公司研发了基于受体的可同时检测13种青霉素 和四环素两类药物的试纸条产品中国农大和北京维德维康 公司合作研发可同时检测15种青霉素和头孢类药物的试纸 条产品
牛样品分析 只需 1 5分钟时间
目前，CHARM被多国政府的农业部和卫生部采用作为的标准方法 如我国: 四环素类（SN/T 2309-2009），β-内酰胺类(GB/T 21174-2007)，磺胺类(GB/T 21173-2007)
CHARM原理
• 微孔板检测系统 • 基于膜的检测系统 • 表面等离子共振传感器
侧流层析技术
免疫渗滤技术
荧光分析系统
受体分析法的优势：可以检测同一类抗生素
难点：受体的制备
青霉素等β-内酰胺类抗生素通过与细菌膜蛋白 结合，抑制细菌细胞壁的生物合成，引起细菌细 胞死亡从而发挥杀菌作用的。这种细菌蛋白被命 名为青霉素结合蛋白(Penicillin-Binding Protein， PBP)
scFv
磺胺类
ScFv 1 Linker ScFv 2
喹诺酮类
双 特 异 性 单 链 抗 体 制 备 策 略
识别磺胺类 和喹诺酮类
Bispesific scFv
pCANTAB 5Ebispesific scFv
Broad-specificity antibody
抗体评价及指导抗体定向改造
重组抗体
Twin Sensor BT
受体分析法
细胞膜上或细胞内能特异识别生物活性分子并与之结合，进 而引起生物学效应的特殊蛋白质
放射性受体分析法 1978年美国波士顿大学教授Charm发明
C H A R M I 是专用于牛奶中β一内酰胺抗生素残留 检测方法， 也是
美国 A O A C承认的第一个快速测定 法， 这个方法非常快速和灵敏，一个奶

气相色谱法（GC） 高效液相色谱法（HPLC） 原子荧光法(AF) 原子吸收法(AA) 气谱-质谱法（GC-MS） 气谱-串联质谱法（GC-MS/MS）


液谱-质谱法（LC-MS）
液谱-串联质谱法（LC-MS/MS）
各种测定方法的灵敏度范围
1 pg/g 1 ng/g 1 g/g 1 mg/g 放射免疫测定法/酶免疫测定法 色质联用分析 放射受体分析 气相色谱(ECD/NPD) 气相色谱(FID) 高效液相色谱(FLD/UVD)
量子点标记免疫分析技术
量子点(quantum dots，QDs)又称半导体纳米 微晶体，是一种由II-VI族或Ⅲ-V族元素组成的，直 径约为1-100nm，能够接受激发光产生荧光的半导 体纳米颗粒，量子点表面结构经过修饰，借助于其 外端的羧基，能与生物分子的氨基相结合，如抗体 等偶联
2、仪器分析方法
H3C N NH N H3C O S O NH2
SM2化学结构
SM2最低能量构象
SM2最高占据轨道 （HOMO）和最低未占 据轨道（LUMO）
玉米赤霉醇类药物的三维构象和电荷分布
玉米赤霉醇类药物的结构信息
体积 Haptens α-zearalanol β-zearalanol α-zearalenol β-zearalenol zearalanone zearalenone Table 2. Physical and chemical indexes of α-zearalanol and analogs V S R Log P P μ H MW 937.37 601.85 90.38 1.16 34.31 2.9499 52.51 322.40 925.51 597.57 90.38 1.16 34.31 0.9922 54.12 322.40 偶极距 903.64 583.54 91.50 疏水性 0.90 34.12 3.2033 52.68 320.39 916.33 644.55 91.50 0.90 34.12 4.208 50.39 320.39 909.49 593.31 89.35 1.37 33.76 3.4748 113.07 320.39 905.71 603.74 90.47 1.10 33.57 5.6308 111.13 318.37
获得的分子结构信息，已用于半抗原的合理设计
Z H Wang， J Z Shen. 2009. Journal of Molecular Recognition, submitted.
单 克 隆 抗 体 制 备 过 程
基因重组抗体制备
脾细胞 杂交瘤细胞
噬 菌 体 展 示 抗 体 库 淘 选 策 略
信 息 含 量 丰 富 的 半 抗 原 合 理 设 计
小分子 计算化学 结构优化 性质参数（物化、 电量、空间等信息） 统计分析 最佳半抗原 免疫动物 抗体 合适 抗原 表位
最佳半抗原
BSA

应用量子力学AM1，得到了磺胺类和玉米赤霉醇类
药物的物化、电性、疏水性等性质，从分子水平比 较各药物与半抗原的异同（化学学报，2008，66， 2613-2619）。为半抗原合理设计提供了方法指导
SM2-FITC
O
TLC分离纯化
Y
测定荧光偏振值
Y
几种兽药检测分析结果
药物 磺胺二甲基嘧啶 磺胺氯吡嗪 磺胺甲氧吡嗪 最低检测限 半数抑制量 ng/mL ng/mL 1 0.25 0.7 16 29 11.5 回收率（%） 鸡肉：78-89 牛奶：60-120 牛奶：68-145 鸡肉：92-132 鸡脂肪：92-121 鸡蛋：125-82 牛奶：70-110


放射免疫测定法
金标试纸条 生物传感器 生物芯片
荧光偏振免疫分析技术
荧 光 偏 振 免 疫 分 析 （ Fluorescence polarization immunoassay，FPIA）是竞争性的均相免疫分析方 法，就是检测荧光标记抗原（tracer）在结合特异性 的抗体前后，荧光偏振值（FP）值的变化，不需要 分离结合的和未结合的抗体，经过几分钟甚至是几 秒钟的温育便可直接测量，很快得到被测药物的浓 度，实验的时间仅仅决定于加样的时间
FPIA 是竞争性的均相免疫分析
抗原浓度高
Ab
Ag
FP值小
Ag
Ag Ag
Ag
F
F
Ag
Ag
Ab
Ag
Ag
Ag
Fห้องสมุดไป่ตู้
Ag
F
Ab
Ab
Ag
抗原浓度低
Ab
Ag
FP值高
Ab
F
Ag
Ag
F
Ag
Ab
Ag
F
Ab
Ag
F
荧光素与磺胺二甲基嘧啶偶联
OH H3C N NH N H3C O S O
COOH
S H N C HN O
双抗夹心TR-FIA反应原理示意图
• 氯霉素 • 莱克多巴胺
化学发光免疫分析技术
化学发光免疫分析（CLIA），一般分 为两种模式。第一种是以发光剂作为酶免 疫测定的底物，通过发光反应增强测定的 敏感性；第二种是以发光剂作为抗体或抗 原的标记物，直接通过发光反应检测标本 中抗原或抗体的含量
Cl-ELISA
极谱法
荧光分光光度法 微生物测定法 紫外/可见分光光度法 比色法
有害化合物残留检测：先用快速 检测产品进行筛查，可疑阳性样 品再用仪器分析方法尤其是色质 联用检测方法加以确证。
美国、欧盟、日本等均采用此策略，抽检数 量超过总样品数的10%！
五、快速检测产品研制
1、快速检测产品种类
目前主要的快速检测产品包括:
马杜霉素
2
160
盐霉素 喹诺酮类（12种）
0.08 0.1-1
33.2 10-20
时间分辩免疫分析技术
时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）是利用镧系络合物作
为标记物的免疫分析技术，其络合物具有荧光寿命长、激发
光谱带较宽、发射光谱带甚窄和Stokes位移大等特点，可以消 除背景荧光的干扰，有效提高检测方法的灵敏度
目的蛋白的表达及纯化
化学发光 免疫检测 氯霉素
ELISA
• Cl-ELISA 与传统ELISA灵敏度比较 Development of a Chemiluminescent ELISA for Determining Chloramphenicol in Chicken Muscle， Journal of Agriculture Food and Chemistry, 2006, 54 (16), 5718–5722
四、有害化合物残留检测技术
兽药等化学物
样品
分离纯化 化学物及 代谢物
固相萃取技术 基质固相分散技术 免疫亲和色谱技术 分子印迹技术 超临界萃取技术
监控
检测方法
快速检测方法 仪器确证方法
1、快速检测方法

微生物抑制测定法 酶联免疫吸附测定法


量子点标记荧光检测法
荧光偏振免疫检测法 化学发光免疫检测法
• • • • • • 试剂盒 试纸条 生物传感器 免疫芯片 快速检测仪 检测箱
2、小分子抗体制备技术
• 目前抗体种类主要是多抗和单抗 • 替代抗体：基因重组抗体、纳米抗体、核酸适配体、抗转 运蛋白、受体、分子印迹聚合物等均有相关研究